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运用SRAP和SSR分子标记研究粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构

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运用SRAP和SSR分子标记研究粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构

作者：蔡小彦南京师范大学

学位级别：硕士

粉花石斛(Dendrobium loddigesii Rofle)是一种濒危的兰科石斛属多年生附生草本植物,具有很高的药用价值和观赏价值。粉花石斛的茎是一种传统的名贵中药材,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、延年益寿等功效。粉花石斛的自然萌发率低... 详细信息

粉花石斛(Dendrobium loddigesii Rofle)是一种濒危的兰科石斛属多年生附生草本植物,具有很高的药用价值和观赏价值。粉花石斛的茎是一种传统的名贵中药材,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、延年益寿等功效。粉花石斛的自然萌发率低且生长缓慢,加上人类的过度采挖,生境的恶化,该物种已经濒临灭绝。因此,亟待需要对该物种的遗传多样性和居群遗传结构进行研究,旨在为合理利用及保护粉花石斛资源提供科学依据。本论文首先利用序列相关扩增多态性(SRAP)分子标记初步探讨了9个粉花石斛野生居群的遗传多样性和居群遗传结构。通过正交试验设计对粉花石斛的SRAP-PCR反应体系进行优化确定最佳的反应体系,并筛选出多态性高、重复性好的引物组合。17对多态性SRAP引物在96个样本扩增后共得到231条条带。结果表明,粉花石斛拥有较高的遗传多样性水平,其中多态性条带有187条,平均多态位点百分比(PPB)为80.52%,平均基因杂合度(H)为0.2743,平均香农信息指数(Ⅰ)为0.4113。遗传分化指数(Gst=0.304)表明粉花石斛居群间存在中等水平的遗传分化。UPGMA聚类分析表明9个居群分为两大支,第一大支贵州茂兰(ML)、广西4个居群(HC, LY, LA, YL)和广东2个居群(SG和YD),第二大支包括海南白沙居群(BS)和云南红河(HH)居群。PCA分析的结果和聚类分析的结果相一致。Mantel test检测表明遗传距离和地理距离之间没有明显正相关性。本论文还对粉花石斛的微卫星进行了开发。利用磁珠富集法构建粉花石斛微卫星文库,筛选出有效SSR标记,共获得12对多态性引物。通过对9个粉花石斛居群的95个个体的扩增发现：每个位点的等位基因数目(A)为3-22个,平均每个位点8.2个等位基因;多态信息含量(PIC)为0.358-0.838,平均多态信息含量是0.637;期望杂合度(He)为0.454-0.857,平均期望杂合度是0.690。这说明开发的12个微卫星位点具有较高的多态性和丰富的信息含量,可以为粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构的研究奠定基础。然后,利用开发的微卫星位点对粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构进行进一步分析。每个居群检测到的等位基因数目是2.62-4.58,每个居群的期望杂合度(He)是0.484-0.665,平均期望杂合度是0.582。结果亦表明粉花石斛具有较高的遗传多样性。AMOVA分析表明居群内的遗传变异占主要部分(82.02%),居群间的变异占总变异的17.98%。聚类分析表明9个野生居群的96个个体分为两大类,且居群间的遗传距离和实际的地理距离没有明显相关性。SSR分析的结果跟SRAP分析结果一致。综上所述,本论文首次结合SRAP和SSR两种分子标记对粉花石斛的遗传多样性和居群遗传结构的进行研究,分析结果对濒危野生粉花石斛资源的合理保护有重要的意义。这两种分子标记也有助于粉花石斛的鉴别、遗传图谱构建、保护生态学和育种等研究。

关键词：粉花石斛 SRAP SSR 遗传多样性居群遗传结构

棉花新材料A111基于cpDNA的种性初步鉴定

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中国农业科技导报 2013年第1期15卷 55-64页

作者：冯坤刘方蔡小彦黎绍惠周忠丽张先亮华金平王坤波中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000 开封市农林科学研究院河南开封475141 中国农业大学农学与生物技术学院杂种优势研究与利用教育部重点实验室作物遗传改良北京市重点实验室北京100193

A111是从澳大利亚收集到的一份新的野生棉,属于澳洲棉、或奈尔逊氏棉乃至一个新的棉种,归属一直没定论。为鉴别A111与澳大利亚以及世界其它地区棉种的差别,以24个棉种(变种)为参照,分析了A111的cpDNA序列特点。结果表明,在15条cpDNA基... 详细信息

A111是从澳大利亚收集到的一份新的野生棉,属于澳洲棉、或奈尔逊氏棉乃至一个新的棉种,归属一直没定论。为鉴别A111与澳大利亚以及世界其它地区棉种的差别,以24个棉种(变种)为参照,分析了A111的cpDNA序列特点。结果表明,在15条cpDNA基本序列中,筛选出了8条序列适合于棉属植物系统发育和种性鉴别研究。这8条序列的变异率和识别率均较高,其中rps16识别率最高(100%)。基于8个序列组合的系统发育分析,能识别单个棉种。聚类结果显示,棉属分为两大分支,A111与奈尔逊氏棉(G3)处于澳洲野生棉分支中的姊妹分支。序列比对结果表明,A111的叶绿体序列存在特异的插入与缺失,明显区别于其他棉种。由此,初步鉴定A111是澳洲野生棉的一个新种,与奈尔逊氏棉的亲缘关系最近。

关键词： A111 cpDNA 棉属物种鉴定

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103份亚洲棉表型多样性分析

植物遗传资源学报 2014年第3期15卷 491-497页

作者：刘方王春英王玉红高伟周忠丽蔡小彦王星星王坤波中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000

对103份分别来源于印度、越南、贵州、广西和云南等不同地域的亚洲棉进行了表型遗传多样性分析。结果发现亚洲棉在质量性状和数量性状上均存在不同程度的遗传多样性；质量性状遗传多样性指数在主茎、叶、花、铃等不同部位表现不同；21... 详细信息

对103份分别来源于印度、越南、贵州、广西和云南等不同地域的亚洲棉进行了表型遗传多样性分析。结果发现亚洲棉在质量性状和数量性状上均存在不同程度的遗传多样性；质量性状遗传多样性指数在主茎、叶、花、铃等不同部位表现不同；21个质量性状的多样性指数为0.04～1.01,平均0.57,3个数量性状的多样性指数为1.65～1.96,平均1.82,表明数量性状的遗传多样性大于质量性状。研究发现不同地域的亚洲棉遗传多样性不同,并将这103份亚洲棉聚类到8个组群。

关键词：亚洲棉表型性状遗传多样性聚类分析

雷蒙德氏棉3条染色体特异BAC的筛选与定位

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棉花学报 2013年第4期25卷 323-328页

作者：覃琴刘方甘仪梅王春英王玉红蔡小彦王坤波中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物遗传资源重点实验室海南海口571101

通过筛选海岛棉BAC文库并结合BAC-FISH技术成功获得雷蒙德氏棉D501、D502和D510染色体的特异BAC克隆,可作为这3条染色体的细胞学标记。这3个克隆在雷蒙德氏棉和海岛棉中进行比较作图,结果表明,它们在海岛棉中均表现出了染色体特异性,说... 详细信息

通过筛选海岛棉BAC文库并结合BAC-FISH技术成功获得雷蒙德氏棉D501、D502和D510染色体的特异BAC克隆,可作为这3条染色体的细胞学标记。这3个克隆在雷蒙德氏棉和海岛棉中进行比较作图,结果表明,它们在海岛棉中均表现出了染色体特异性,说明这3个BAC也可用于海岛棉Db01、Db02和Db10染色体的识别。其中BAC克隆280G06在两棉种10号染色体上的位置为非线性关系,可能在棉属的进化过程中发生了染色体结构的变异。

关键词：雷蒙德氏棉单染色体细菌人工染色体荧光原位杂交

海岛棉A亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定

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棉花学报 2013年第3期25卷 227-233页

作者：程华甘仪梅刘方蔡小彦王春英王玉红王坤波中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000 安阳工学院河南安阳455000 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物遗传资源重点实验室海南海口571101

以1套13个陆地棉A亚组染色体特异的BAC克隆为探针,与海岛棉Pima90-53、红星草棉和阿非利加棉染色体进行荧光原位杂交。这些探针均在染色体上产生了特异信号,从而鉴别了这3个棉种基因组的单染色体。因此,这套BAC克隆也可以作为这3个基因... 详细信息

以1套13个陆地棉A亚组染色体特异的BAC克隆为探针,与海岛棉Pima90-53、红星草棉和阿非利加棉染色体进行荧光原位杂交。这些探针均在染色体上产生了特异信号,从而鉴别了这3个棉种基因组的单染色体。因此,这套BAC克隆也可以作为这3个基因组染色体的细胞遗传学标记。在此基础上,对3个棉种的A(亚)组染色体物理序号进行了命名。根据这些分子标记和连锁群的关系,染色体物理序号和遗传连锁图谱间可实现相互转化。这将有助于研究棉属不同棉种间的起源演化关系,以及新的遗传标记的染色体物理定位和构建染色体物理图谱等。

关键词：棉花单染色体荧光原位杂交染色体物理序号

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雷蒙德氏棉细菌人工染色体文库的构建

分子植物育种 2016年第8期14卷 2172-2177页

作者：武亚磊王玉红刘玉玲王春英蔡小彦王星星周忠丽王坤波刘方彭仁海郑州大学郑州450000 中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室安阳455000 安阳工学院安阳455000

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记开发、物理作图等研究的重要基因组资源。本研究以二倍体野生棉雷蒙德氏棉(***,D5)为材料,从成株期暗培养的黄化幼嫩叶片中得到纯净... 详细信息

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记开发、物理作图等研究的重要基因组资源。本研究以二倍体野生棉雷蒙德氏棉(***,D5)为材料,从成株期暗培养的黄化幼嫩叶片中得到纯净、完整和高质量的基因组DNA。经脉冲场凝胶电泳检测,所提取基因组DNA大于700 kb。经酶切、片段选择、连接转化,构建了雷蒙德氏棉的基因组BAC文库,文库共包含26 880个克隆,平均插入片段为127 kb,覆盖该棉种全基因组的3.7倍左右,克隆空载率小于5%。该文库的构建,为雷蒙德氏棉基因组物理图谱的构建、功能基因的定位与克隆、以及比较基因组研究提供了重要的基因组资源。

关键词：细菌人工染色体文库野生棉雷蒙德氏棉

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棉花叶绿体基因组全序列微卫星分布规律研究

棉花学报 2015年第6期27卷 570-575页

作者：蔡小彦刘方周忠丽王星星王春英王玉红王坤波棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所河南安阳455000

利用已公布的陆地棉（Gossypium hirsutum）叶绿体基因组全序列测序结果,应用生物信息学软件对其叶绿体微卫星的分布规律进行了全面分析。结果发现,陆地棉叶绿体基因组上共有72个微卫星,主要分布于大单拷贝区和小单拷贝区,且以单碱基微... 详细信息

利用已公布的陆地棉（Gossypium hirsutum）叶绿体基因组全序列测序结果,应用生物信息学软件对其叶绿体微卫星的分布规律进行了全面分析。结果发现,陆地棉叶绿体基因组上共有72个微卫星,主要分布于大单拷贝区和小单拷贝区,且以单碱基微卫星为主,占总数的76.4%;二碱基微卫星占总数的20.8%;三碱基微卫星占总数的2.8%。在单碱基微卫星中,又以A/T重复为主,二者共占单碱基微卫星的92.7%。单碱基微卫星的重复次数以10~12次为主,二碱基微卫星的重复次数以5~6次为主。本研究结果为开发棉属植物叶绿体通用引物提供了理论依据。

关键词：棉花叶绿体微卫星分布规律

半野生棉与亚洲棉对草甘膦抗性评价及比较分析

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棉花学报 2016年第2期28卷 95-103页

作者：王园园刘方周忠丽蔡小彦王玉红黎绍惠王春英张香娣王星星王坤波棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所河南安阳455000 河南科技学院河南新乡453003

采用叶片棉球定位鉴定法,初步鉴定并评价了半野生棉和亚洲棉对草甘膦的自然抗性,结果表明:参试材料抗性水平从高抗至高感分6级,极端抗性水平相差33.3倍(0.2%对0.006%)。其中,半野生棉对草甘膦的自然抗性分级丰富,抗性水平分布自高抗至高... 详细信息

采用叶片棉球定位鉴定法,初步鉴定并评价了半野生棉和亚洲棉对草甘膦的自然抗性,结果表明:参试材料抗性水平从高抗至高感分6级,极端抗性水平相差33.3倍(0.2%对0.006%)。其中,半野生棉对草甘膦的自然抗性分级丰富,抗性水平分布自高抗至高感;但大部分半野生棉不耐草甘膦,近86%(346份)的材料抗性水平处于低耐级别以下。而亚洲棉抗性水平都处于高抗至低耐的4个级别,抗性多样性较差,但整体抗性水平较高,70.3%(71份)表现为耐或以上级别。从半野生棉和亚洲棉中分别筛选到2份和5份高抗材料,半野生棉中有1份高感材料,亚洲棉中无对草甘膦敏感材料。本研究报道的极端材料为棉花草甘膦抗性遗传机制研究、新品种的培育、内源抗性基因的挖掘和感抗机理研究,奠定了良好的材料基础。

关键词：半野生棉亚洲棉草甘膦抗性评价

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棉花RAV基因家族的全基因组分析

棉花学报 2014年第6期26卷 471-482页

作者：卢合均周忠丽陈浩东凌键刘方蔡小彦王星星王春英王玉红王坤波中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000 湖南省棉花科学研究所湖南常德415101 中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081

在二倍体棉花D5基因组(Gossypium raimondii Ulb.)数据库中鉴定出10个RAV基因,分布于4、5、8、9、13号染色体;在二倍体棉花A2基因组(Gossypium arboreum L.)数据库中鉴定出10个RAV基因,与棉花D5基因组的R AV成员的数量和序列具有一一对... 详细信息

在二倍体棉花D5基因组(Gossypium raimondii Ulb.)数据库中鉴定出10个RAV基因,分布于4、5、8、9、13号染色体;在二倍体棉花A2基因组(Gossypium arboreum L.)数据库中鉴定出10个RAV基因,与棉花D5基因组的R AV成员的数量和序列具有一一对应的同源关系,推测棉花A、D组的祖先种中可能存在10个RAV基因。对植物R AV蛋白序列做系统发育分析,将R AV成员分为4个组;发现棉花R AV基因可能参与了棉属所特有的基因组多倍化事件的证据。对N CBI中陆地棉(Gssypium hirsutum L.)EST、Unigene数据库做比对统计,得到陆地棉不同组织中R AV基因表达情况;对陆地棉受黄萎病菌胁迫后的荧光定量检测,发现棉花RAV基因与棉花响应黄萎病菌的胁迫相关。

关键词： RAV基因转录因子 AP2结构域 B3结构域基因复制黄萎病