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靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第2期40卷 121-128页

作者：蒙若彤王鹏举赵晓娟郑瑞梁思辛张依婷董昊韩玉洁杨安钢白占涛阎博路凡延安大学生命科学学院陕西延安716000 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院免疫学教研室陕西西安710032 新乡医学院医学检验学院河南新乡453003

目的利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文... 详细信息

目的利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2+肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明,提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2+肿瘤细胞。

关键词：嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞同种异体底盘细胞细胞外囊泡

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靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞毒性作用的体内外验证

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第4期40卷 289-295页

作者：张仪婷席文锦王鹏举赵晓娟郑瑞梁思辛蒙若彤阎博杨安钢空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院免疫学教研室陕西西安710032 延安大学生命科学学院陕西延安716000

目的对靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞进行毒理学评估,为其后期HER2-CAR-T细胞治疗的临床上评估提供安全性依据。方法利用重组慢病毒载体制备HER2-CAR-T细胞,采用软琼脂集落形成实验,观察HER2-CAR-T细胞集落... 详细信息

目的对靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞进行毒理学评估,为其后期HER2-CAR-T细胞治疗的临床上评估提供安全性依据。方法利用重组慢病毒载体制备HER2-CAR-T细胞,采用软琼脂集落形成实验,观察HER2-CAR-T细胞集落形成情况并对集落形成率进行统计分析;将HER2-CAR-T细胞悬液与兔红细胞悬液共孵,通过直接观察法以及酶标仪检测法评估红细胞溶解情况;对雄性新西兰兔耳缘静脉注射HER2-CAR-T细胞制剂,通过组织切片染色观察HER2-CAR-T细胞对动物血管的刺激作用;以pMD 2.G载体上的水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白(VSV-G)基因为目标序列,利用荧光定量PCR进行慢病毒载体安全性的验证;取接受HER2-CAR-T细胞输注的小鼠心、肝、肺、肾,HE染色观察其病变情况。结果成功制备了HER2-CAR-T细胞,这些细胞在体外不具备软琼脂集落形成能力,HER2-CAR-T细胞制剂对新西兰兔红细胞不产生溶血现象。新西兰兔耳缘静脉输注HER2-CAR-T细胞后未发现明显血管刺激反应,也未检测到VSV-G的特异性扩增,治疗组小鼠心、肝、肺、肾组织未见明显病变。结论所制备的HER2-CAR-T细胞具有可靠安全性。

关键词：安全性毒理学靶向人表皮生长因子2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞集落形成实验溶血血管刺激性器官毒性

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T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用

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细胞与分子免疫学杂志 2023年第5期39卷 397-403页

作者：梁思辛郑瑞赵晓娟张仪婷王鹏举蒙若彤阎博杨安钢新乡医学院医学技术学院河南新乡453003 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032 延安大学生命科学学院陕西延安716000 空军军医大学基础医学院免疫学教研室陕西西安710032

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病... 详细信息

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。

关键词： T细胞活力响应性启动子(TARP) 萤光素酶报告基因系统嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR⁃T cells)

基于OSMAC策略对海洋细菌Moraxella sp. S017-3活性代谢产物的研究

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基于OSMAC策略对海洋细菌Moraxella sp. S017-3活性代谢产物的研究

作者：钱若彤大连海洋大学

学位级别：硕士

海洋是人类的自然资源宝库,特殊的生境使得海洋微生物所产生的次生代谢产物的结构类型复杂,且具有抗病毒,抗氧化等丰富的生物活性。这也就使得海洋微生物天然产物逐渐成为人类研发新药物的潜在来源。通过OSMAC（单菌株多次级代谢产物）... 详细信息

海洋是人类的自然资源宝库,特殊的生境使得海洋微生物所产生的次生代谢产物的结构类型复杂,且具有抗病毒,抗氧化等丰富的生物活性。这也就使得海洋微生物天然产物逐渐成为人类研发新药物的潜在来源。通过OSMAC（单菌株多次级代谢产物）策略能够激发微生物的潜力,从而获得更加丰富且活性良好的次生代谢产物,是近年来的研究热点。本文对来自渤海海域（120°06′43.2″E,38°17′34.8″N）底泥样品（编号S017）进行研究,通过稀释涂布法分离纯化,得到6株海洋细菌,结合分子生物学鉴定,表型特征鉴定为莫拉氏菌Moraxella sp.S017-3、微球菌Micrococcus sp.S017-4、芽胞杆菌Bacillus sp.S017-5、普利斯特菌Priestia sp.S017-8及两株大肠杆菌。对菌株分别进行小规模发酵培养,选用有机溶剂萃取,得到乙酸乙酯层和正丁醇层粗提物样品,对其进行抗氧化活性测定以及抑菌活性测定,发现粗提物均具有一定活性。其中,菌株S017-3正丁醇层粗提物对羟基自由基的清除活性较强,IC值为0.075 mg·m L,甚至低于Vc的IC值。且菌株S017-3粗提物均对金黄色葡萄球菌具有一定抑菌活性。综合比较分析菌株粗提物的活性,选择菌株Moraxella sp.S017-3进一步研究。基于OSMAC策略对菌株Moraxella sp.S017-3的培养条件进行优化,改变培养基种类、培养时间、培养基p H值以及渗透压（葡萄糖浓度）等培养条件,将得到的次生代谢产物经TLC（薄层色谱法）分析以及HPLC（高效液相色谱法）分析,测定其抗氧化活性和抑菌活性,得到的实验结果作为筛选指标。实验结果表明菌株在编号为3S-C的条件下产生的粗提物活性最佳。粗提物3SY-C和3SZ-C在DPPH自由基清除活性实验中,IC值分别为0.145 mg·m L和0.264 mg·m L;粗提物3SZ-C在羟基自由基活性测定中,IC值为0.026 mg·m L;粗提物3SY-C和3SZ-C对枯草芽孢杆菌表现出抑菌活性,抑菌圈直径分别为8.1 mm和7.0 mm,此抑菌活性在优化菌株的培养条件之前未被检测出;在HPLC图谱中结果显示主产物峰有7个。因此确定适宜条件3S-C(SYP培养基,p H值为6,时间48 h,葡萄糖10 g·L),振荡培养菌株Moraxella sp.S017-3。在上述3S-C培养条件下,大量培养菌株Moraxella sp.S017-3的发酵液35 L,依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取,除去溶剂,得到菌株乙酸乙酯层次生代谢产物（1.08 g）和菌株正丁醇层次生代谢产物（4.42 g）。由于两者存在包含关系,即合并进行研究得到粗提物共5.5 g,选用甲醇和二氯甲烷充分溶解后滤掉杂质,再经由常压正向硅胶柱层析、HPLC等方法分离纯化,获得8个化合物,经NMR(H-NMR、C-NMR)、理化性质及与文献数据比对等方法进行结构分析,分别鉴定为胸腺嘧啶（thymine）、环[（S）-脯氨酸-甘氨酸]（cyclo-[S-Pro-Gly]）、环[（S）-脯氨酸-8-羟基-（R）-异亮氨酸](cyclo-[（S）-Pro-8-hydroxy-（R）-Ile])、4-羟基苯乙醇（4-Hydroxyphenethyl alcohol）、N-乙酰色胺（N-acetyltryptamine）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate,DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和D-（+）-核糖酸-1,4-内酯（D-Ribonolactone）,分属于生物碱类、环二肽类、酚类、邻苯二甲酸酯类及糖内酯类化合物。8个化合物均为首次从该菌中分离得到。

关键词：海洋细菌 OSMAC 菌株Moraxella sp. 活性代谢产物分离纯化

黑龙江省水稻低温冷害指数保险产品设计与费率厘定

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黑龙江省水稻低温冷害指数保险产品设计与费率厘定

作者：武若彤河北经贸大学

学位级别：硕士

黑龙江省以其肥沃的黑土地和充足的耕地资源为我国农业生产做出了重大贡献,粮食产量已14年蝉联全国第一,其中水稻为黑龙江省主要种植作物之一,2022年产量约占该省粮食总产量的37%。然而,受大陆季风性气候影响,黑龙江省天气状况不稳定、... 详细信息

黑龙江省以其肥沃的黑土地和充足的耕地资源为我国农业生产做出了重大贡献,粮食产量已14年蝉联全国第一,其中水稻为黑龙江省主要种植作物之一,2022年产量约占该省粮食总产量的37%。然而,受大陆季风性气候影响,黑龙江省天气状况不稳定、气候变化频繁,再加上年均气温偏低,水稻易遭受低温冷害风险,这给该省水稻生产带来了很大不确定性,影响了水稻产量及农户种植收入。目前,黑龙江省政府主要通过实施传统的政策性农业保险为农户转移农业生产过程中的经营风险。然而传统农业保险具有交易成本高、易出现道德风险和逆向选择、难以完全弥补农户损失等一系列问题。天气指数保险作为一款创新型保险产品,具有承保理赔程序简单、有效降低道德风险和逆向选择等优点,可在一定程度上解决传统农业保险存在的问题。本文研究内容主要包括以下几个方面:首先,分析黑龙江省水稻种植现状及气候条件,对黑龙江省水稻生产低温冷害历史灾情进行论述。其次,论证设计黑龙江省水稻低温冷害指数保险的必要性,并剖析设计黑龙江省水稻低温冷害指数保险的可行性。再次,分析国内外天气指数保险发展较好地区的现状和做法,总结可资借鉴的经验启示。最后,设计黑龙江省水稻低温冷害指数保险产品并测算费率,预测在未来推广过程中可能出现的问题并提出相应对策建议。本文创新点在于:(1)研究选题较新。目前,黑龙江省在天气指数保险方面进行的探索较少,相应保险产品相对缺乏。本文以黑龙江省水稻天气指数保险为研究对象,设计低温冷害指数保险产品并测算保险费率,选题具有新意。(2)研究内容较新。现有天气指数保险大多以降水量为气象因子,并且主要集中在沿海发达地区。本文系统研究黑龙江省水稻低温冷害指数保险产品的可行性和必要性,设计保险产品要素并测算费率,对未来推广过程中可能出现的问题进行预测并提出解决措施。

关键词：农业保险天气指数保险费率厘定

从网络社会到平台社会——传播结构的去中心化到再中心化

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探索与争鸣 2024年第3期 156-165,180页

作者：沈国麟易若彤复旦大学信息与传播研究中心复旦大学新闻学院上海200433

在社会由网络社会向平台社会发展的历程中,全球传播网络结构经历了从去中心化到再中心化的转变,形成了全新的社会形态。具体而言,在技术层面,在全球范围内连接更多节点的诉求促成了互联网技术的不断发展,并对社会结构和形态产生影响;在... 详细信息

在社会由网络社会向平台社会发展的历程中,全球传播网络结构经历了从去中心化到再中心化的转变,形成了全新的社会形态。具体而言,在技术层面,在全球范围内连接更多节点的诉求促成了互联网技术的不断发展,并对社会结构和形态产生影响;在资本层面,以获利为动力,互联网对社会经济制度和资本运作形态进行了再结构,从信息资本主义发展到平台资本主义。传播结构变化在组织形态和权力结构两个方面反映出“从去中心化到再中心化”的社会规律和特征。同时,这两种状态在相互博弈中可能会使未来全球传播结构出现新生态和新趋势。

关键词：网络社会平台社会去中心化再中心化数字平台

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医疗网络中无证书并行密钥隔离聚合签名方案

计算机工程与应用 2024年第1期60卷 289-300页

作者：蒙彤郭瑞王翊丞刘颖菲西安邮电大学网络空间安全学院西安710121 西安邮电大学无线网络安全技术国家工程实验室西安710121

无线传感器网络在医疗领域的应用,为医生和患者带来了极大的便利。由于传输过程中会导致患者隐私信息被破坏,医疗数据的真实性和完整性成为了医疗行业一大难题。为解决此难题,无证书聚合签名方案被提出保护患者隐私信息。然而,大多数方... 详细信息

无线传感器网络在医疗领域的应用,为医生和患者带来了极大的便利。由于传输过程中会导致患者隐私信息被破坏,医疗数据的真实性和完整性成为了医疗行业一大难题。为解决此难题,无证书聚合签名方案被提出保护患者隐私信息。然而,大多数方案都无法抵御完全选择密钥攻击,并存在密钥暴露问题。为此,提出了可抵御完全选择密钥攻击的无证书并行密钥隔离聚合签名方案。该方案基于区块链技术进行数据共享和身份追踪,利用边缘计算的实时性处理无线传感器网络中高延迟问题,同时使用并行密钥隔离方法解决密钥暴露问题。在随机谕言机模型下,基于椭圆曲线离散对数问题证明该方案的不可伪造性,基于哈希的强抗碰撞性证明方案可抵御完全选择密钥攻击。使用MIRACL库进行效率分析,表明该方案在各阶段运行效率要优于其他相关方案,同时具有较低的通信开销。

关键词：边缘计算无证书聚合签名并行密钥隔离完全选择密钥攻击

移动医疗系统中的可撤销无证书代理重签名方案

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信息安全学报 2024年第3期9卷 1-18页

作者：郭瑞刘颖菲王翊丞蒙彤西安邮电大学网络空间安全学院西安710121 西安邮电大学无线网络安全技术国家工程实验室西安710121

代理重签名在保证委托双方私钥安全的前提下,通过半可信代理实现了双方签名的转换,在本文方案中,通过代理重签名实现了在通信过程中终端用户对于身份的隐私要求。移动医疗服务系统因为其有限的计算和存储能力,需要借助云服务器来对医疗... 详细信息

代理重签名在保证委托双方私钥安全的前提下,通过半可信代理实现了双方签名的转换,在本文方案中,通过代理重签名实现了在通信过程中终端用户对于身份的隐私要求。移动医疗服务系统因为其有限的计算和存储能力,需要借助云服务器来对医疗数据进行计算和存储。然而,在将医疗数据外包给云服务器后,数据便脱离了用户的控制,这给用户隐私带来了极大地安全隐患。现有的无证书代理重签名方案大多都不具有撤销功能,存在着密钥泄露等安全性问题。为了解决这一问题,本文提出了一种可撤销的无证书代理重签名方案,在不相互信任的移动医疗服务系统中,实现了医疗数据传输过程以及云存储过程中的用户匿名性,同时,本文方案具有单向性和非交互性,更适合在大规模的移动医疗系统中使用。此外,当用户私钥泄露时,本文利用KUNode算法实现了对用户的高效撤销,并利用移动边缘计算技术将更新密钥和撤销列表的管理外包给移动边缘计算设备,降低了第三方的计算成本,使其具有较低的延迟。最后,在随机谕言机模型下证明了所构造的方案在自适应选择消息攻击下的不可伪造性,并利用JPBC库与其他方案进行计算与通信开销的对比。其结果表明,本方案在具备更优越的功能的同时,具有较小的计算成本、通信成本和撤销成本。

关键词：无证书代理重签名随机谕言机模型外包撤销移动医疗系统云计算

暴露高活性晶面TiO的制备及其对甲基橙的光催化降解性能研究

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应用化工 2024年

作者：于磊许文龙崔若彤刘会娥滨州市科技创新发展研究院中国石油大学(华东)重质油国家重点实验室

以硫酸钛(Ti(SO4)2)做钛源，以氢氟酸（HF）做形貌控制剂，通过一锅水热法制备了暴露高活性{001}晶面的TiO2光催化剂，采用SEM、TEM、XRD、XPS等进行表征。以甲基橙染料为目标降解物，考察了原料的配比、反应温度、反应时间等因素对TiO... 详细信息

以硫酸钛(Ti(SO4)2)做钛源，以氢氟酸（HF）做形貌控制剂，通过一锅水热法制备了暴露高活性{001}晶面的TiO2光催化剂，采用SEM、TEM、XRD、XPS等进行表征。以甲基橙染料为目标降解物，考察了原料的配比、反应温度、反应时间等因素对TiO2光催化剂降解效果的影响。结果表面，当F/Ti为1.0（即HF添加量为1.0mL），水热反应温度为180℃，水热反应时间为12h时制备的TiO2样品对甲基橙的降解率能达到92.5%。TiO2对甲基橙的光催化降解符合一级动力学过程。

关键词：高活性晶面 TiO 光催化甲基橙染料降解