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ASFV抗原重组腺病毒的构建及免疫保护效果

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黑龙江畜牧兽医 2024年

作者：惠丽丽岳慧贤蒋依倩张艳艳齐宇李思齐付林李其炫扈荣良中国农业科学院长春兽医研究所

为了构建非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗原重组腺病毒并探讨不同抗原的免疫原性,试验以ASFV基因Ⅱ型SY18株基因组为模板,采用无缝连接技术构建13种带有His标签的ASFV抗原重组腺病毒,通过间接免疫荧光技术鉴定重组腺... 详细信息

为了构建非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗原重组腺病毒并探讨不同抗原的免疫原性,试验以ASFV基因Ⅱ型SY18株基因组为模板,采用无缝连接技术构建13种带有His标签的ASFV抗原重组腺病毒,通过间接免疫荧光技术鉴定重组腺病毒在HEK-239AD细胞中的表达情况,并用构建的13种重组腺病毒与前期构建的25种重组腺病毒分别于试验第0,14,28天免疫小鼠,200μL/只(重组腺病毒稀释至1×108TCID50/mL)。第3次免疫后第7天,通过摘眼球方法采集血液,制备血清,利用血清中和试验筛选出5种效果较好的可刺激动物机体产生ASFV抑制性抗体的抗原,并将这5种重组腺病毒混合后免疫猪只,每种重组腺病毒(稀释至1×108TCID50/mL)用量为0.5 mL/头;首免(第0天)后第14天进行二免,二免后第14天口服ASFV基因Ⅱ型SY18株(效价为1×104TCID50/mL) 200μL攻毒,探究重组腺病毒免疫保护效果。结果表明:本次试验构建的13种重组腺病毒均能在HEK-239AD细胞中稳定表达;从免疫小鼠血清中和试验筛选出5种抑制ASFV效果较好的重组腺病毒为rAdCMV-D129L、rAdCMV-EP84R、rAdCMV-E146L、rAdCMV-NP419L、rAdCMV-S273R。5头免疫重组腺病毒的猪均在攻毒后延迟发病,其中4头猪最终死亡,1头存活,保护率为20%,免疫PBS的猪只在攻毒后发病快,并全部死亡。说明ASFV抗原重组腺病毒可以刺激机体产生免疫反应,但用经过血清中和试验筛选出来的5种抗原制备的重组腺病毒无法提供完全保护。

关键词：非洲猪瘟病毒重组腺病毒抗原鉴定病毒复制抑制性抗体

浅析医院会计信息化建设存在的问题和优化策略

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中文科技期刊数据库（全文版）社会科学 2023年第5期 70-72页

作者：蒋依倩无锡市第五人民医院江苏无锡214000

在医疗卫生体制改革不断深入的今天,医院会计信息化建设已经成为了支撑医院实现长期发展的关键,信息化建设不仅能够降低财务会计人员的工作强度,还能在提高工作效率的同时保障工作质量。通过分析对医院会计信息化建设进行分析,可以在解... 详细信息

在医疗卫生体制改革不断深入的今天,医院会计信息化建设已经成为了支撑医院实现长期发展的关键,信息化建设不仅能够降低财务会计人员的工作强度,还能在提高工作效率的同时保障工作质量。通过分析对医院会计信息化建设进行分析,可以在解决信息化建设问题的同时,为医院的未来发展奠定基础。本文对医院会计信息化建设进行分析,并对医院会计信息化建设中的问题与优化策略提出个人看法,希望为关注医院会计信息化建设的人群带来参考。

关键词：医院财务会计信息化建设

猪源大肠杆菌、沙门菌裂解性噬菌体的分离鉴定与初步应用

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猪源大肠杆菌、沙门菌裂解性噬菌体的分离鉴定与初步应用

作者：蒋依倩吉林农业大学

学位级别：硕士

大肠杆菌与沙门菌是养殖环境中广泛存在的革兰阴性病原菌,主要引起仔猪严重腹泻和败血症,给养殖业带来巨大的经济损失。近年来,随着抗生素滥用及养殖密度增加,大量耐药及多重耐药菌株不断涌现,使得大肠杆菌病和沙门菌病的防治变得越来... 详细信息

大肠杆菌与沙门菌是养殖环境中广泛存在的革兰阴性病原菌,主要引起仔猪严重腹泻和败血症,给养殖业带来巨大的经济损失。近年来,随着抗生素滥用及养殖密度增加,大量耐药及多重耐药菌株不断涌现,使得大肠杆菌病和沙门菌病的防治变得越来越困难。噬菌体具有天然的杀菌能力,能特异性感染并杀死细菌,可作为一种新型的抗生素补充制剂,正被人们广泛关注。本研究利用药敏试验成功筛选出具有多重耐药性的临床分离大肠杆菌SY株与猪霍乱沙门菌CVCC3383株作为宿主菌,经双层琼脂法从健康猪新鲜粪便中分离到相应的裂解性噬菌体EP-SY和SP3383。并对EP-SY和SP3383进行生物学特性及抗感染初步应用研究。生物学特性检测结果显示,噬菌体EP-SY和SP3383对宿主具有较强的特异性,裂解谱较窄;两者的遗传物质都均为双链DNA分子;对氯仿和乙醚不敏感,无囊膜。EP-SY属肌尾病毒科,头部呈二十面体立体对称,直径80.00±5.71 nm,尾长85.71±9.89 nm,对温度和酸碱环境耐受能力强,可耐受40～65℃或pH值3～12的环境,最佳感染复数为0.01,潜伏期约10 min,爆发期约70 min,平均爆发量约为22.8 PFU/cell。噬菌体SP3383头部呈球形,直径41.40±0.33 nm,有一不可伸缩的长尾,尾长96.49±0.38 nm,属长尾病毒科,可耐受40～65℃或pH值4～11的环境,最佳感染复数为0.1,潜伏期约30 min,爆发期约60 min,平均爆发量约48 PFU/cell。噬菌体EP-SY和SP3383分别对耐药大肠杆菌和沙门菌具有很强的体外裂解活性,对小鼠无明显毒副作用。分别灌胃接种EP-SY、SP3383可使宿主菌感染小鼠脾脏和肠道组织内活菌数显著下降,肠道病变减轻。综上所述,本研究所分离到的噬菌体EP-SY和SP3383可分别裂解多重耐药大肠杆菌和沙门菌,对宿主菌感染小鼠具有一定的预防和治疗作用,为后续应用噬菌体奠定了基础。

关键词：耐药大肠杆菌耐药沙门菌噬菌体生物学特性初步应用

新型冠状病毒S蛋白RBD区的重组猫疱疹病毒的构建及鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2022年第23期 72-77,135页

作者：王凤杰周鑫韬齐宇韩桪蒋依倩陈腾扈荣良吉林农业大学长春130118 中国农业科学院长春兽医研究所长春130122

为了开发一种猫用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组猫疱疹病毒活载体疫苗,试验以猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)为病毒载体,采用同源重组技术将亲本病毒FHV-Z的gI和gE基因替换为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)和增强型绿色荧光蛋白(E... 详细信息

为了开发一种猫用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组猫疱疹病毒活载体疫苗,试验以猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)为病毒载体,采用同源重组技术将亲本病毒FHV-Z的gI和gE基因替换为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP蛋白)串联表达盒;利用Overlap PCR方法构建包含RBD-EGFP串联表达盒的重组质粒pUC19-RBD-EGFP,并用该重组质粒与FHV-Z基因组共同转染F81细胞,通过有限稀释法和绿色荧光病变灶筛选完成重组病毒rFHV-RBD的纯化;经PCR、测序、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot方法分析重组病毒rFHV-RBD;用1×10^(7.0)TCID_(50)/mL的重组病毒rFHV-RBD滴鼻免疫猫,利用ELISA方法监测免疫后第0,7,14,21天猫体内特异性抗RBD抗体变化情况。结果表明:试验成功拯救了重组病毒rFHV-RBD,该重组病毒连续传代15代仍能检测到RBD-EGFP串联表达盒,遗传稳定性较好,重组病毒rFHV-RBD的生长特性与亲本病毒FHV-Z无明显差异,能够在重组病毒感染的F81细胞中正确表达S-RBD蛋白,滴鼻免疫猫后第21天特异性抗RBD抗体极显著升高(P<0.01)。说明试验获得的重组病毒rFHV-RBD具有良好的免疫原性,可用于开展猫新型冠状病毒肺炎疫苗的研究。

关键词：新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域猫疱疹病毒Ⅰ型免疫原性

多重耐药猪源大肠杆菌裂解性噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究

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黑龙江畜牧兽医 2016年第9期 169-171,175,295,296页

作者：蒋依倩齐宇徐凤宇吉林农业大学动物科技学院长春130118

为了促进噬菌体在动物医学领域的应用，试验采用单层琼脂验证、双层琼脂噬菌斑纯化法筛选多重耐药猪源大肠杆菌的裂解性噬菌体。结果表明：从健康猪粪便中分离并纯化到了双链DNA、有收缩肌鞘的肌尾噬菌体EP—SY，该噬菌体合有限制性内切... 详细信息

为了促进噬菌体在动物医学领域的应用，试验采用单层琼脂验证、双层琼脂噬菌斑纯化法筛选多重耐药猪源大肠杆菌的裂解性噬菌体。结果表明：从健康猪粪便中分离并纯化到了双链DNA、有收缩肌鞘的肌尾噬菌体EP—SY，该噬菌体合有限制性内切酶DraI的酶切位点；可裂解宿主菌以外的耐药大肠杆菌，但不裂解猪肠道常在大肠杆菌；可耐受pH值3～12或40-65℃的环境；最佳感染复数为0．01；潜伏期约为10min，爆发期约为70min，平均爆发量为22．8pfu／cell.说明筛选得到的裂解性噬菌体EP—SY可能会作为快速、安全防治猪大肠杆菌病的候选毒株。

关键词：大肠杆菌多重耐药裂解性噬菌体分离鉴定生物学特性

非洲猪瘟病毒I226R蛋白原核表达及检测I226R抗体间接ELISA方法的建立

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中国兽医学报 2022年第12期42卷 2347-2355页

作者：柯军男张国军岳慧贤张艳艳齐宇蒋依倩陈腾李影扈荣良吉林农业大学动物医学学院吉林长春130118 吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130122

本实验室前期构建了缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)减毒株SY18△I226R,将其高、低单剂量(分别为10^(7)TCID_(50)和10^(4)TCID_(50))接种家猪21 d后,对致死剂量ASFV SY18毒株的攻击,免疫猪均能达到100%保护,具有作为ASF疫苗候选株的... 详细信息

本实验室前期构建了缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)减毒株SY18△I226R,将其高、低单剂量(分别为10^(7)TCID_(50)和10^(4)TCID_(50))接种家猪21 d后,对致死剂量ASFV SY18毒株的攻击,免疫猪均能达到100%保护,具有作为ASF疫苗候选株的潜力。为了能够有效区别家猪感染ASFV野毒株和SY18△I226R减毒株,本试验从ASFV SY18株基因组中扩增得到I226R基因片段,克隆到原核表达载体pET32a,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,纯化后获得I226R蛋白(pI226R)。以纯化的pI226R为包被抗原,以不同缺失毒免疫猪或自然毒感染康复猪血清为检测对象,建立了针对pI226R抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,pI226R重组质粒在BL21(DE3)细胞中经IPTG诱导表达,获得的蛋白大小为28 kDa。以pI226R为包被抗原的间接ELISA检测结果显示,该方法对阴性猪血清和SY18△I226R疫苗候选株接种猪血清检测的D_(450 nm)值均≤0.381;ASFV自然感染猪血清和其他基因缺失株抗体水平的D_(450 nm)值均>0.381,与其他ASFV抗体检测试剂盒如p30或p54等配合,可有效鉴别I226R基因缺失株接种和其他毒株感染,具有重要潜在应用价值。

关键词：非洲猪瘟病毒 I226R蛋白原核表达间接ELISA

猪霍乱沙门菌裂解性噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究

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中国兽药杂志 2015年第11期49卷 5-10页

作者：蒋依倩齐宇徐凤宇吉林农业大学动物科技学院长春130118

以药敏试验筛选出的多重耐药猪霍乱沙门菌为宿主,经双层琼脂纯化法从健康猪粪便中获得裂解性噬菌体SP3383。电镜观察发现该噬菌体为长尾病毒科成员;酶切分析表明其基因组为大于47.4 kb的双链DNA,可被限制性内切酶Nco I和BamH I酶切;生... 详细信息

以药敏试验筛选出的多重耐药猪霍乱沙门菌为宿主,经双层琼脂纯化法从健康猪粪便中获得裂解性噬菌体SP3383。电镜观察发现该噬菌体为长尾病毒科成员;酶切分析表明其基因组为大于47.4 kb的双链DNA,可被限制性内切酶Nco I和BamH I酶切;生物学特性研究表明SP3383对温度和酸碱环境耐受力较好;最佳感染复数为0.1,潜伏期约为30 min,爆发期约60 min,平均爆发量为48 PFU/cell。本研究可为应用噬菌体治疗耐药猪霍乱沙门菌感染提供参考。

关键词：猪霍乱沙门菌裂解性噬菌体生物学特性

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噬菌体在动物细菌病防治中的应用研究进展

中国兽药杂志 2015年第5期49卷 66-69页

作者：蒋依倩齐宇王美玲徐凤宇吉林农业大学动物科技学院长春130118 吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室长春130118

综述了毒性噬菌体在防治大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌所致畜禽或实验动物传染病及副溶血弧菌、鳗弧菌、铜绿假单胞菌等所致水产动物传染病中的应用进展,以期为相关领域研究提供参考。

关键词：噬菌体动物细菌病防治

分枝杆菌噬菌体CJAUS 5株lysA基因的克隆与表达

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中国兽医杂志 2015年第9期51卷 22-24页

作者：蒋依倩宋磊齐宇姜秀云高云航徐凤宇吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

为了研究分枝杆菌噬菌体裂解酶lys A的生物学特性及对宿主菌的作用,对分枝杆菌肌尾噬菌体CJAUS5的lys A基因进行PCR扩增、克隆和原核表达,并利用生物信息软件对其序列进行分析。结果显示,CJAUS5-lys A基因与Gen Bank中分枝杆菌肌尾噬菌... 详细信息

为了研究分枝杆菌噬菌体裂解酶lys A的生物学特性及对宿主菌的作用,对分枝杆菌肌尾噬菌体CJAUS5的lys A基因进行PCR扩增、克隆和原核表达,并利用生物信息软件对其序列进行分析。结果显示,CJAUS5-lys A基因与Gen Bank中分枝杆菌肌尾噬菌体的lys A基因具有高度同源性;克隆基因在大肠杆菌BL21中获得了成功表达,重组蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为52 k Da;lys A蛋白保守区域分析结果显示,lys A包含具有酰胺酶活性的肽聚糖识别蛋白(PGRP)超家族,表明Lys A可能具有裂解肽聚糖的能力。本研究克隆表达出分枝杆菌噬菌体CJAUS5裂解酶Lys A,为进一步研究其相关功能奠定了基础。

关键词：分枝杆菌噬菌体 lysA基因克隆原核表达