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杆状病毒凋亡抑制基因IAP1促进家蚕CyclinB的核内积累

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微生物学报 2022年第9期62卷 3478-3488页

作者：肖苗董战旗肖琴胡志刚王杰陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400715 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400715

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是生产上危害最严重的病原之一。BmNPV感染Bm N-SWU1细胞将细胞周期阻滞于G2/M期。CyclinB是调控细胞周期G2期向M期转换的重要细胞周期蛋白。因此,研究BmNPV感染后C... 详细信息

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是生产上危害最严重的病原之一。BmNPV感染Bm N-SWU1细胞将细胞周期阻滞于G2/M期。CyclinB是调控细胞周期G2期向M期转换的重要细胞周期蛋白。因此,研究BmNPV感染后CyclinB变化对解析病毒调控细胞周期的机制具有重要意义,同时探究这个过程中与CyclinB互作的病毒蛋白,可为构建家蚕转基因品系提供分子靶标。【方法】q RT-PCR检测BmNPV感染后BmCyclinB的表达变化;免疫荧光观察病毒感染前后BmCyclinB的定位变化,通过细胞质细胞核蛋白分离实验验证。免疫共沉淀钓取与BmCyclinB互作的病毒蛋白。BmNPV感染期间敲除BmNPV IAP1观察BmCyclinB的入核比例。【结果】BmNPV感染后BmCyclinB转录水平下调。BmNPV感染前BmCyclinB主要定位于细胞质,而感染后主要定位于细胞核。BmNPV感染Bm N-SWU1细胞后促进BmCyclinB在核内积累。共钓取了7个与BmCyclinB互作的病毒蛋白,免疫共沉淀和细胞共定位证明BmNPV IAP1与BmCyclinB之间存在相互作用。敲除BmNPV IAP1后BmCyclinB进入细胞核的数量显著减少。【结论】BmNPV IAP1可通过与BmCyclinB互作,促进BmCyclinB在核内积累。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒细胞周期细胞周期蛋白B 凋亡抑制蛋白1

家蚕核型多角体病毒lef-11基因RNA干扰策略的优化

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微生物学报 2016年第10期56卷 1561-1570页

作者：陈婷婷董战旗胡楠胡志刚鲁成潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业部家蚕功能基因组和生物学重点实验室重庆400716

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)lef-11基因作为杆状病毒高度保守的晚期表达因子之一,对病毒晚期基因的表达极其重要。因此对lef-11基因进行有效RNA干扰将提高宿主细胞对BmNPV的抗性。【方法】本... 详细信息

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)lef-11基因作为杆状病毒高度保守的晚期表达因子之一,对病毒晚期基因的表达极其重要。因此对lef-11基因进行有效RNA干扰将提高宿主细胞对BmNPV的抗性。【方法】本文基于经典的sh-RNA-loop骨架及家蚕内源性的miRNA骨架,构建以BmNPV lef-11基因为靶标的干扰载体pIZ-shRNA1、pIZ-shRNA2和pIZ-Ds RedamiR279;分别构建基于A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4和hsp70启动子驱动的干扰载体,用以评价不同启动子驱动的干扰载体的抗病毒效果,并对干扰载体进行优化。【结果】首先,本文通过比较miRNA-based和shRNA-based RNAi载体对同一靶基因同一位点的干扰效率,发现pIZ-Ds Red-amiR279对BmNPV lef11基因的干扰效率超过90%,远优于shRNA-based RNAi载体的干扰效果;其次,通过对干扰载体进行优化,发现IE1启动子的效果最优,由其驱动的pIZ-Ds Red-milef11干扰载体也是本研究中的最优干扰载体,对病毒的增殖抑制效果最为明显。【结论】对目的基因的干扰效果并非启动子的活性越高、miRNA积累得越多就越好,只有综合考虑干扰片段的选择、启动子的活性以及靶基因自身的功能等多方面的因素,才能提高干扰效率,达到干扰目的。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒 RNA干扰 lef-11 载体优化启动子

对家蚕抗核型多角体病毒的研究策略及研究进展

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蚕业科学 2017年第1期43卷 139-146页

作者：董战旗潘敏慧家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 农业部家蚕功能基因组和生物学重点实验室西南大学重庆400716

由家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)引发的家蚕血液型脓病是生产上危害最为严重的蚕病之一。国内外学者从研究家蚕的抗病遗传规律、选育对病毒具有抵抗力的家蚕品种,一直到应用现代分子生物学技术研究病毒的基因组、转录组和蛋白组,研究病毒... 详细信息

由家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)引发的家蚕血液型脓病是生产上危害最为严重的蚕病之一。国内外学者从研究家蚕的抗病遗传规律、选育对病毒具有抵抗力的家蚕品种,一直到应用现代分子生物学技术研究病毒的基因组、转录组和蛋白组,研究病毒的侵染规律及与蚕体的互作,基于RNAi和CRISPR/Cas9技术培育转基因抗病毒素材等,已经取得了诸多进展。本文系统总结近10年来有关家蚕抗Bm NPV研究在上述各个方面取得的重要成果,并对未来家蚕抗病毒机制研究和抗病毒分子育种趋势以及亟需解决的科学与技术问题进行探讨,以期为不断深入的家蚕抗病毒研究提供参考。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒抗性分子机制抗性育种素材

家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定

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中国农业科学 2019年第2期52卷 376-384页

作者：董战旗蒋亚明潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定Bm... 详细信息

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。

关键词：家蚕 BmHSP60 相互作用蛋白免疫共沉淀 BmANT1 BmHSP90

家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

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生物工程学报 2021年第12期37卷 4342-4350页

作者：董战旗秦琪张新铃李柯洁陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400716

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/C... 详细信息

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类(Ⅴ型)能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1)表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。

关键词：家蚕基因编辑 CRISPR/Cpf1

家蚕ADP/ATP转运酶(BmANT)抑制BmNPV增殖作用机制研究

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微生物学报 2019年第8期59卷 1474-1483页

作者：董战旗蒋亚明陈鹏潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400716

[目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)隶属于杆状病毒,需要借助宿主细胞能量代谢进行自身增殖复制。家蚕ADP/ATP转运酶(Bombyx mori ADP/ATP translocase,BmANT)是线粒体转运蛋白,在BmNPV感染条件下和家蚕热休克蛋白60(heat shock protein 60,BmHSP60)具有直接的相互作用。因此,鉴定Bmant基因在BmNPV感染过程中的功能特征,有助于解析杆状病毒劫持宿主细胞因子促进自身增殖复制机制,完善杆状病毒和宿主相互作用网络。[方法]通过结构域预测BmANT蛋白的结构特征,荧光定量PCR分析Bmant基因在BmNPV感染后的变化特征;并过表达BmANT检测其对病毒DNA复制和病毒蛋白表达变化影响;进一步在转录水平分析Bmant和Bmhsp60基因的调控关系;最后通过流式细胞术等技术鉴定Bmant和Bmhsp60基因共同调控BmNPV增殖复制的机制。[结果] SMART软件预测显示BmANT包含3个线粒体载体结构域,BmNPV感染24 h后Bmant基因持续下调表达。过表达Bmant基因能够显著抑制BmNPV DNA的复制和VP39蛋白表达。荧光定量PCR分析显示Bmant和Bmhsp60基因具有相互拮抗作用,能够相互抑制转录。Bmant和Bmhsp60共同过表达分析显示,BmANT和BmHSP60共同作用BmNPV能够抑制病毒的增殖复制。[结论]结果表明,BmANT是一个线粒体载体蛋白,具有显著的抗病毒作用,能够下调Bmhsp60基因表达,并抑制BmNPV增殖复制。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒 BmANT BmHSP60 抗病毒

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八年级物理上学期期中测试题

中学生数理化(八年级物理)(配合人教社教材) 2014年第10期 31-33+42页

作者：董战旗

家蚕抗性品系NC99R抗BmNPV作用机制分析

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生物工程学报 2020年第1期36卷 100-108页

作者：董战旗雷雪蛟秦琪张新铃唐亮石美宁潘敏慧西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400716 西南大学农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室重庆400716 广西壮族自治区蚕业技术推广总站广西南宁530007

家蚕Bombyxmori是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,由家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的家蚕血液型脓病每年给我国蚕桑产业造成巨大的经济损失。文中拟通过鉴定目前存在的家蚕抗病毒品系NC99R抗性特征... 详细信息

家蚕Bombyxmori是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,由家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的家蚕血液型脓病每年给我国蚕桑产业造成巨大的经济损失。文中拟通过鉴定目前存在的家蚕抗病毒品系NC99R抗性特征,初步解析其抗BmNPV机制,以期为家蚕抗病品系分子机制解析提供一定参考。将对照组大造(Dazao,DZ)品系和实验组NC99R抗性品系家蚕幼虫分别定量添食BmNPV包涵体(Occlusion bodies,OB),计算DZ和NC99R品系对BmNPV的半致死剂量(Median lethal dose,LD50),结果显示DZ品系半致死剂量为1.2×10^5多角体/头,抗性品系NC99R的半致死剂量为1.8×106多角体/头,抗性水平相比对照组提高15倍左右。进一步统计分析DZ和NC99R品系口服感染1×10^6多角体/头和体腔注射1×10^6粒子/头出芽型病毒粒子(Budded virus,BV)后的死亡率,结果显示DZ品系死亡高峰集中在第4–6天,NC99R抗性品系死亡高峰集中在第6–8天,与对照相比延迟1–2 d。通过RT-PCR分析BmNPV DNA拷贝数,显示DZ在口服感染和体腔注射后BmNPV基因组都快速增殖,抗性品系NC99R BmNPV DNA拷贝数缓慢增加。HE染色分析显示DZ和NC99R品系在口服感染前期没有显著差异,感染到96 h,DZ中肠细胞核变大,成脱落趋势;而抗性品系NC99R,细胞核膨大,但细胞排列仍较整齐。RT-PCR分析病毒不同时期基因表达显示抗性品系NC99R在口服感染和体腔注射24h后早期基因ie-1开始下调表达,其他时期基因随即下调表达;最后维持在较低表达水平或消失。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒抗性 NC99R

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“眼睛和眼镜”“显微镜和望远镜”练习

中学生数理化(八年级物理)(配合人教社教材) 2015年第11期 27-28+42页

作者：董战旗