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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) LAMP检测方法的建立

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水产研究 2024年第1期11卷 30-37页

作者：孙妍董学旺魏俊利顾中华陈浩楠刘群张丽包海岩天津市动物疫病预防控制中心天津天津市水生动物疫病监测中心天津天津市农业发展服务中心天津

本研究建立了一种检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。根据GenBank中注册的IHHNV-VN基因序列设计出6条特异性引物,成功建立了IHHNV-LAMP检测方法。该方法检出限为6 copies/μl,且与对虾其它常见疫病均无交叉反应。采用LAMP和常规PCR方法对40份具有典型IHHNV感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP方法的阳性检出率为97.5%,PCR方法的阳性检出率为85%,表明建立的IHHNV-LAMP方法不仅具有高灵敏度、高特异性而且还有较高的准确性,能够为对虾传染性皮下及造血组织坏死病的早期快速诊断提供技术支撑。

关键词：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒环介导等温扩增检测方法

患“牛奶病”中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)主要组织病理学时序变化的研究分析

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水产研究 2024年第2期11卷 62-70页

作者：孙妍栾晓筱张丹刘群董学旺陈浩楠魏俊利黄亚冬天津市动物疫病预防控制中心水生动物疫病监测中心天津天津农学院水产学院天津天津宏泽水产养殖有限公司天津

本文采用HE染色方法,对人工感染二尖梅奇酵母河蟹的前、中、后期的各组织进行组织病理学分析。结果显示,各组织出现不同程度的病理损伤并呈现时序变化特征,其中肝胰腺、鳃和肌肉组织的破坏程度最为严重,肠道和心脏组织病变程度较低。本... 详细信息

本文采用HE染色方法,对人工感染二尖梅奇酵母河蟹的前、中、后期的各组织进行组织病理学分析。结果显示,各组织出现不同程度的病理损伤并呈现时序变化特征,其中肝胰腺、鳃和肌肉组织的破坏程度最为严重,肠道和心脏组织病变程度较低。本文明确了不同感染时期河蟹各组织的病理变化特征,为河蟹“牛奶病”的早期诊断提供了科学的理论依据,同时为进一步了解该病的致病机制提供理论支撑。

关键词：中华绒螯蟹组织病理时序变化

鱼类迟缓爱德华氏菌肠溶口服疫苗的制备及免疫保护效应研究

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天津农学院学报 2024年第2期31卷 51-55页

作者：魏俊利薛淑霞孙妍王雪惠董学旺孙金生天津市动物疫病预防控制中心天津300402 天津师范大学生命科学学院天津300387 天津市水产研究所天津300221

本文采用海藻酸钠作为载体,采用乳化复沉淀方法包裹迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)全菌制备疫苗微球。制备工艺研究结果表明:3%(m/v)海藻酸钠溶液,4%(m/v)CaCl_(2)溶液,水油相比1∶2,乳化剂Span801%,搅拌速度1200 r/min为最佳制备... 详细信息

本文采用海藻酸钠作为载体,采用乳化复沉淀方法包裹迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)全菌制备疫苗微球。制备工艺研究结果表明:3%(m/v)海藻酸钠溶液,4%(m/v)CaCl_(2)溶液,水油相比1∶2,乳化剂Span801%,搅拌速度1200 r/min为最佳制备工艺,微球包埋率达91.04%,微球平均粒径(16.51±11.87)μm。通过人工胃肠液对疫苗微球的耐受性进行分析,微球在体外人工模拟胃液和肠液中16h释放率分别为0.8%和98.1%。用表达有绿色荧光蛋白的大肠杆菌做示踪标记,口灌免疫半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther),疫苗能耐受胃的酸性环境影响,通过前消化道到达后肠。免疫保护效应研究表明,口腔灌注疫苗后,出现特异性和非特异性免疫应答,疫苗组在初免后第14天血清效价达到峰值1∶322;外周血白细胞吞噬率在初免后第14天达到峰值27.06%,吞噬指数在初免后第14天达到峰值1.65。初免后第28天用迟缓爱德华氏菌活菌攻毒,对照组死亡率58.82%,疫苗组死亡率13.33%,免疫保护率为77.33%。本研究优化了鱼类肠溶口服疫苗的制备工艺,疫苗免疫评价结果表明,该口服疫苗可以有效激活鱼体免疫反应,预防鱼类疾病发生。

关键词：迟缓爱德华氏菌口服疫苗肠溶微球免疫保护效应

天津地区1例中华绒螯蟹“牛奶病”病原分离、鉴定及其病理特征分析

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2023年第3期49卷 435-444页

作者：刘群孙妍王菁魏俊利董学旺陈浩楠天津市动物疫病预防控制中心天津300402 天津市水生动物疫病监测中心天津300402

为探究天津地区中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)“牛奶病”案例的病原,本研究采用流行病学调查、病原分离、18S rDNA基因序列分析、人工感染试验和免疫组织化学分析来明确病原种类及其组织分布特征、时序变化特征。结果表明:自然发病蟹... 详细信息

为探究天津地区中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)“牛奶病”案例的病原,本研究采用流行病学调查、病原分离、18S rDNA基因序列分析、人工感染试验和免疫组织化学分析来明确病原种类及其组织分布特征、时序变化特征。结果表明:自然发病蟹的主要临床症状包括对外界刺激反应慢或基本不反应,头胸甲腔内蓄积乳白色血淋巴,头胸部及步足基部关节膜连接处肌组织呈不透明乳白色,肝胰腺呈白色半流体糜烂状。基于18S rDNA基因序列的系统发育分析表明,真菌分离株P13被鉴定为二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)。人工感染试验结果表明,真菌分离株P13能够在实验室条件下感染健康中华绒螯蟹[累积死亡率为(55.0±2.4)%],导致实验蟹呈现与自然发病蟹相似的临床症状,且能从实验蟹中再分离出二尖梅奇酵母。免疫组织化学分析结果表明,真菌分离株P13能够侵染中华绒螯蟹肝胰腺、后肠、鳃、心脏和肌组织,引起靶组织不同程度的病理损伤并呈现时序变化特征。综上所述,二尖梅奇酵母是天津地区中华绒螯蟹“牛奶病”的病原,本文也初步揭示了该病原的主要靶组织及组织分布特征和时序变化特征,为深入研究二尖梅奇酵母的致病机制提供了理论依据,为中华绒螯蟹“牛奶病”的防控提供了技术支撑。

关键词：中华绒螯蟹牛奶病二尖梅奇酵母人工感染试验免疫组织化学

一例天津源患螺原体病中华绒螯蟹主要组织病理分析

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微生物前沿 2022年第3期11卷 169-176页

作者：刘群孙妍董学旺陈浩楠魏俊利天津市动物疫病预防控制中心天津天津市水生动物疫病监测中心天津

应用组织病理学方法对天津地区首例患螺原体病中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)眼柄视神经节、肝胰腺、胸腹神经团、肌、心脏、肠及鳃组织进行病理分析。结果显示,病蟹对外界刺激不敏感,附肢环爪状紧缩,呈间歇性痉挛状抖动;表明患病蟹主... 详细信息

应用组织病理学方法对天津地区首例患螺原体病中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)眼柄视神经节、肝胰腺、胸腹神经团、肌、心脏、肠及鳃组织进行病理分析。结果显示,病蟹对外界刺激不敏感,附肢环爪状紧缩,呈间歇性痉挛状抖动;表明患病蟹主要组织器官发生不同程度病理变化,主要表现为:眼柄视神经节整体结构界限不清,神经细胞间隙扩大,部分细胞空泡化,受损严重;鳃组织细胞广泛变性,鳃叶腔扩张,鳃叶间隙可见较多小瓜虫寄生;肝胰腺组织细胞水肿、变性,小管间隙被血淋巴浸润;肠组织除部分基膜坏死及血淋巴浸润外,组织结构基本正常;肌组织纤维排列紊乱,部分肌纤维肿胀、溶解、坏死,纤维间隙较大;胸腹神经团大部分神经细胞空泡变性,细胞核崩解;心脏组织部分心肌纤维浊肿,横纹消失、坏死;其中,鳃叶腔、肝胰腺小管间隙、肌结缔组织、胸腹神经团中疏松结缔组织以及心肌纤维间结缔组织均被嗜酸性菌体浸润。综上所述,眼柄视神经节、鳃、肝胰腺、肌、胸腹神经团、心脏组织可能是病原体侵染中华绒螯蟹的主要组织器官,导致以上组织器官发生严重组织病变,使得机体进行正常新陈代谢能力降低,最终因病原体侵染以上组织而导致组织器官功能衰竭可能是病蟹死亡的主要原因。

关键词：中华绒螯蟹螺原体病组织病理

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)基因组不同提取方法的比较

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水产研究 2023年第1期10卷 23-30页

作者：魏俊利孙妍陈浩楠刘群张丽董学旺天津市动物疫病预防控制中心天津天津市水生动物疫病监测中心天津

为探寻最佳EHP基因组提取方法,本研究采用传统酚/氯仿抽提法、改良酚/氯仿抽提法、几丁质酶法、商品化海洋动物DNA提取试剂盒及商品化植物DNA提取试剂盒共5种方法分别对等量的EHP进行基因组提取。提取的基因组浓度由高到低依次为:商品... 详细信息

为探寻最佳EHP基因组提取方法,本研究采用传统酚/氯仿抽提法、改良酚/氯仿抽提法、几丁质酶法、商品化海洋动物DNA提取试剂盒及商品化植物DNA提取试剂盒共5种方法分别对等量的EHP进行基因组提取。提取的基因组浓度由高到低依次为:商品化海洋动物DNA提取试剂盒(18.825 ng/µL) > 几丁质酶法(17.17 ng/µL) > 改良酚/氯仿抽提法(15.06 ng/µL) > 传统酚/氯仿抽提法(10.8 ng/µL) > 商品化植物DNA提取试剂盒(2.175 ng/µL);提取的基因组完整性由高到低依次为:商品化海洋动物DNA提取试剂盒 > 改良酚/氯仿抽提法 > 商品化植物DNA提取试剂盒 > 传统酚/氯仿抽提法 > 几丁质酶法。由上述结论可知,采用商品化海洋动物DNA提取试剂盒提取的EHP基因组浓度最高,且完整性最好,是5种方法中最佳的提取方法。

关键词：虾肝肠胞虫基因组提取传统酚/氯仿抽提法改良酚/氯仿抽提法几丁质酶法商品化海洋动物DNA提取试剂盒商品化植物DNA提取试剂盒

患“牛奶病”中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)主要组织病理观察

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水产研究 2022年第2期9卷 48-54页

作者：刘群孙妍魏俊利董学旺陈浩楠王菁张丹天津市动物疫病预防控制中心天津天津市水生动物疫病监测中心天津天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室天津

应用组织病理学方法,对患“牛奶病”中华绒螯蟹肝胰腺、肌、肠组织进行观察。结果显示,病蟹活力较弱,对外界刺激反应慢或基本不反应,头胸甲腔内蓄积有乳白色血淋巴,头胸部肌组织及步足基部关节膜连接处呈不透明乳白色,肝胰腺呈白色半流... 详细信息

应用组织病理学方法,对患“牛奶病”中华绒螯蟹肝胰腺、肌、肠组织进行观察。结果显示,病蟹活力较弱,对外界刺激反应慢或基本不反应,头胸甲腔内蓄积有乳白色血淋巴,头胸部肌组织及步足基部关节膜连接处呈不透明乳白色,肝胰腺呈白色半流体糜烂状;肝胰腺细胞排列紊乱,部分基膜破裂,多数细胞核固缩、溶解,存在大量空泡并游离于小管腔,有大量呈蓝色嗜碱性菌体聚集、堆积;部分肠粘膜脱落并游离于肠腔,脱落部位的单层柱状细胞排列较松散,结缔组织层增大变厚,存在大量呈蓝色嗜碱性菌体堆积;肌纤维排列紊乱,呈结构性肿胀、断裂、溶解、坏死,部分细胞完全溶解消失,肌纤维束排列松散、不规则,纤维间结缔组织被蓝色嗜碱性菌体浸润。

关键词：中华绒螯蟹牛奶病组织病理

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风送挤涂法聚合物水泥砂浆衬里材料的研制

石油工程建设 1991年第3期17卷 27-29页

作者：田广墅董学旺中国石油天然气总公司工程技术研究所

在普通水泥砂浆中加入PL-1无毒聚合物外加剂,结合风送挤涂工艺进行水管线内防腐,解决了该工艺久已存在的质量问题,使其防腐性能大为提高。

关键词：管道水泥砂浆衬里防腐

天津地区1例凡纳滨对虾病害的病原学检测与分析

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微生物前沿 2023年第2期12卷 55-62页

作者：孙妍刘群徐赟霞陈浩楠赵良玮董学旺魏俊利天津市动物疫病预防控制中心天津天津市水生动物疫病监测中心天津

采用流行病学调查、细菌分离鉴定、寄生虫观察和分子生物学方法对天津滨海新区凡纳滨对虾养殖场采集的1例患病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)样品开展病原学研究。寄生虫和细菌鉴定结果显示,患病对虾未发现寄生虫和细菌感染;病原学... 详细信息

采用流行病学调查、细菌分离鉴定、寄生虫观察和分子生物学方法对天津滨海新区凡纳滨对虾养殖场采集的1例患病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)样品开展病原学研究。寄生虫和细菌鉴定结果显示,患病对虾未发现寄生虫和细菌感染;病原学检测结果显示,患病对虾虾肝肠胞虫(EHP)和传染性肌坏死病毒(IMNV)核酸检测结果均为阳性,其它相关病原检测结果均为阴性;EHP、IMNV目的基因产物测序后经NCBI BLAST,与已报道的EHP、IMNV相关序列相似性分别介于99.56%~100%、98.33%~100%;系统发育树分析结果显示,本研究EHP孢壁蛋白1基因与马来西亚分离株、印度尼西亚分离株、泰国分离株及印度分离株的EHP孢壁蛋白1基因聚为一支,亲缘关系较近;IMNV TJ2022 OQ438431与印度尼西亚分离株、印度分离株、巴西分离株聚为一支,亲缘关系较近。揭示本研究凡纳滨对虾发病样品可能由EHP和IMNV感染所致,需引起养殖从业者的高度关注。

关键词：细菌分离鉴定孢壁蛋白细菌感染病原检测病原学检测核酸检测细菌鉴定坏死病毒