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2023年江苏省猴痘病例临床和流行病学特征分析

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国际病毒学杂志 2024年第2期31卷 109-113页

作者：居豪王笑辰梁姝怡张楠胡洋刘慧朱小娟赵康辰葛以跃李瑞云胡建利江苏省疾病预防控制中心急性传染病预防控制所南京210009 南京市疾病预防控制中心急性传染病预防控制所 210003 苏州市疾病预防控制中心传染病预防控制科 215004 江苏省疾病预防控制中心病原微生物研究所 210009 南京医科大学公共卫生学院 211166

目的描述江苏省猴痘的临床和流行病学特征,为疫情防控提供经验。方法使用中国疾病预防控制信息系统和流行病学调查信息系统等的数据,采用Excel 2016软件进行整理和分析数据并绘制发病与报告时间分布图,分析江苏省2023年猴痘的临床和流... 详细信息

目的描述江苏省猴痘的临床和流行病学特征,为疫情防控提供经验。方法使用中国疾病预防控制信息系统和流行病学调查信息系统等的数据,采用Excel 2016软件进行整理和分析数据并绘制发病与报告时间分布图,分析江苏省2023年猴痘的临床和流行病学特征。结果江苏省2023年确诊的120例猴痘病例以散发为主,集中在7~9月,潜伏期为8.0(5.0,11.0)d,主要通过男男性行为传播。患者主要特征为男男性行为者(95.0%)、青壮年(21~45岁,占95.0%)、未婚(68.3%)和无业(49.2%),部分患有艾滋病(46.7%)和梅毒(23.3%)等性传播疾病。临床症状以皮损(91.7%)、发热(60.8%)、淋巴结肿大(37.5%)和头痛(22.5%)为主。病例主要通过主动就诊(90.8%)被发现,发病至就诊和发病至诊断的中位间隔时间分别为2.5 d和7.0 d。结论应继续加强猴痘监测,同时针对男男性行为人群等高危人群加强健康教育。

关键词：猴痘流行病学特征临床特征男男性行为人群

重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas13a结合侧流层析技术快速检测猴痘病毒

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中国病毒病杂志 2024年第3期14卷 274-281页

作者：杨宁马君妍孟子欣蓉赵康辰吴涛朱小娟乔乔吴斌崔仑标葛以跃南京医科大学公共卫生学院江苏南京210029 江苏省疾病预防控制中心国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室江苏省新发突发重大传染病病原微生物重点实验室江苏南京210029

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)和规则成簇间隔短回文重复序列(cluste redregularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)-Cas13a(CRISPRassociated protein 13a)结合侧流层析技术(lateral flow assay,LFA)建立一种快速、灵敏、特异的猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)检测方法。方法针对MPXV的F3L段基因设计其RAA扩增引物、CRISPR RNA(crRNA)、荧光报告探针及LFA探针,对反应条件进行优化,建立RAA-CRISPR/Cas13a-LFA检测体系,评价该体系的检测灵敏度与特异性,并与实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测结果进行一致性比较,同时应用实际临床样本验证该检测体系的准确性。结果RAA-CRISPR/Cas13aLFA检测体系可以在60 min内(包括实验操作)完成检测,该体系对病毒DNA的检出限为18拷贝/反应;特异性试验表明其与水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、柯萨奇病毒A16型(CVA16)、肠道病毒A组71型(EV-A71)、麻疹病毒(measles virus,MeV)均无交叉反应;临床样本检测结果表明,RAA-CRISPR/Cas13a-LFA与qPCR法之间的差异无统计学意义,二者具有良好的检测一致性(Kappa=0.892)。RAACRISPR/Cas13a-LFA检测体系的灵敏度和特异度分别为100.0%和83.3%,阳性预测值为96.6%,阴性预测值为100.0%。结论建立的RAA-CRISPR/Cas13a-LFA检测体系可快速、灵敏、特异地检测MPXV。

关键词：重组酶介导的等温扩增技术 CRISPR-Cas13 侧流层析技术猴痘病毒检测

MIRA-CRISPR/Cas13a结合磁珠量子点传感器快速检测甲型流感病毒方法的建立

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江苏预防医学 2024年第4期35卷 403-407页

作者：杨宁马君妍赵康辰吴涛朱小娟乔乔王烁虎歌吴斌崔仑标葛以跃国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室江苏省新发突发重大传染病病原微生物重点实验室江苏省疾病预防控制中心南京医科大学公共卫生学院

目的将多酶恒温快速扩增(MIRA)、成簇的规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白Cas13a(CRISPR/Cas13a)与研发的磁珠量子点(MBQD)传感器相结合，建立一种甲型流感病毒(IAV)快速检测方法。方法针对IAV的M基因设计并筛选MIRA扩增引物、CRISP... 详细信息

目的将多酶恒温快速扩增(MIRA)、成簇的规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白Cas13a(CRISPR/Cas13a)与研发的磁珠量子点(MBQD)传感器相结合，建立一种甲型流感病毒(IAV)快速检测方法。方法针对IAV的M基因设计并筛选MIRA扩增引物、CRISPR RNA (crRNA)、荧光报告探针及连接探针，对反应条件进行优化，建立MIRA-CRISPR/Cas13a-MBQD检测体系；评价该体系的检测灵敏度与特异性；比较建立的方法与实时荧光RT-PCR(RT-qPCR)法的一致性。结果建立的检测体系可以在60 min内完成检测，对IAV的检测灵敏度达1 copy RNA分子/反应；特异性试验表明其与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、乙型流感病毒(IBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(HMPV)、副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)、肺炎支原体(MP)均无交叉反应；临床样本检测结果显示，MIRA-CRISPR/Cas13a-MBQD与RT-qPCR法具有极高的检测一致性(Kappa=1.00)。结论建立的MIRA-CRISPR/Cas13a-MBQD检测体系可快速检测IAV,灵敏性、特异性较好。

关键词：多酶恒温快速扩增 CRISPR/Cas13a 量子点传感器甲型流感病毒快速检测

刚地弓形虫感染对孕鼠脾脏及母胎界面CD4～+CD25～+调节性T细胞的影响

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刚地弓形虫感染对孕鼠脾脏及母胎界面CD4～+CD25～+调节性T细胞的...

作者：葛以跃南京医科大学

学位级别：硕士

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是人畜共患细胞内寄生原虫，所致的弓形虫病呈世界性分布。对免疫功能正常机体，弓形虫感染一般仅造成隐性感染状态，但妇女在怀孕期间感染弓形虫却可以导致流产、死胎、死产以及胎儿先天性异常等不良妊... 详细信息

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是人畜共患细胞内寄生原虫，所致的弓形虫病呈世界性分布。对免疫功能正常机体，弓形虫感染一般仅造成隐性感染状态，但妇女在怀孕期间感染弓形虫却可以导致流产、死胎、死产以及胎儿先天性异常等不良妊娠结局。在弓形虫感染过程中，垂直感染是否是导致流产或胚胎死亡发生的唯一因素，目前尚不明确。动物模型和人群流行病学研究均提示，刚地弓形虫不需要将虫体垂直传播给胎儿就可以引起流产和胚胎吸收的发生，这就表明，除了垂直感染以外，某些未知因素可能促成了弓形虫感染过程中流产的发生。在怀孕过程中，母体免疫系统得耐受胚胎抗原的持续刺激。已有研究结果提示，许多机制参与了胚胎抗原对母体免疫攻击的逃避过程。越来越多的证据表明，CD4CD25调节性T细胞在怀孕免疫耐受状态的维持中起到尤为重要的作用。在小鼠，缺乏CD4CD25调节性T细胞将导致胚胎排斥，通过过继正常孕鼠CD4CD25调节性T细胞后能有效降低流产的发生。人群研究也证实了CD4CD25调节性T细胞在维持正常妊娠过程中的重要性。但是迄今为止，弓形虫感染引起的流产与CD4CD25调节性T细胞的关系尚无研究报道。结合上述资料，本研究旨在探讨孕鼠在感染弓形虫后体内CD4CD25调节性T细胞数量以及功能相关基因Foxp3(forkhead box P3)表达水平的变化，并初步探讨其变化机制，为从新的角度研究弓形虫感染致流产发生机制提供实验资料。我们首先建立刚地弓形虫感染孕鼠模型，并设立对照组。在感染后的不同时间点，采用实时荧光定量PCR方法检测Foxp3 mRNA在脾细胞以及胎盘组织中表达水平的变化。以三色流式细胞术检测小鼠脾脏组织中CD4CD25Foxp3T细胞相对比例的变化，并对其进行绝对计数。运用免疫组织化学染色法观察母胎界面Foxp3细胞的分布。最后采用TUNEL(末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端原位标记)法及Hoechst 33342染色法检测弓形虫感染孕鼠脾脏CD4CD25T细胞的凋亡情况。本研究获得如下主要结果： 1．刚地弓形虫感染孕鼠呈现异常妊娠孕鼠在弓形虫感染后第6天，所有胚胎均发生出血、坏死和吸收，流产率(胚胎吸收率)显著高于对照组水平。组织病理学观察发现，流产鼠胎盘有明显的出血表现，并伴有淋巴细胞浸润。 2．感染鼠脾细胞Foxp3 mRNA表达水平降低实时荧光定量PCR结果显示，与同期对照组相比，孕鼠脾细胞Foxp3 mRNA表达水平从感染后第4天开始下降(P＜0.01)，到感染后第6天显著低于同期对照组水平(P＜0.01)。非孕鼠在感染弓形虫以后，脾细胞Foxp3 mRNA表达水平也显著降低(P＜0.01)，其变化趋势与感染孕鼠类似。 3．感染鼠脾脏CD4CD25Foxp3T细胞数量减少流式细胞仪检测结果表明，孕鼠脾脏CD4CD25Foxp3T细胞占脾细胞的比例从感染后第2天开始下降，但差别无统计学意义(P＞0.05)，在感染后第4天进一步下降(P＜0.01)，到了感染后第6天，显著低于对照组水平(P＜0.01)。与之相一致，脾脏CD4CD25Foxp3T细胞的绝对数目在感染后第4天和第6天均明显低于同期对照组水平(P＜0.01)。与孕鼠相似，非孕鼠在感染刚地弓形虫以后，脾脏CD4CD25Foxp3T细胞占脾细胞的比例以及绝对数目均显著降低(P＜0.01)。 4．母胎界面Foxp3 mRNA水平及Foxp3细胞数在感染后均下调胎盘Foxp3 mRNA表达水平在弓形虫感染后第6天显著低于同期对照组水平(P＜0.01)。与Foxp3基因水平变化相一致，免疫组化结果显示，正常孕鼠母胎界面有较多的Foxp3细胞分布，而感染第6天孕鼠母胎界面Foxp3细胞数明显减少。 5．孕鼠感染弓形虫后脾脏CD4CD25T细胞发生凋亡在感染后第4天，分离孕鼠脾脏单个核细胞，采用TUNEL法(流式细胞仪)检测细胞凋亡，结果发现，感染鼠脾脏CD4CD25T细胞TUNEL阳性率显著高于对照组(P＜0.01)。Hoechst 33342染色结果亦表明，与对照组相比，更多的分离自感染鼠脾脏的CD4+CD25+T细胞发生凋亡。本实验采用弓形虫感染孕鼠模型研究弓形虫感染对机体CD4CD25调节性T细胞的影响，发现孕鼠在感染弓形虫后脾脏及母胎界面CD4CD25调节性T细胞减少，而调节性T细胞的减少可能与弓形虫感染引起的细胞凋亡相关。我们的研究结果提示，感染引起的CD4CD25调节性T细胞的减少在弓形虫感染致流产发生过程中可能起到重要的作用。

关键词：刚地弓形虫 CD4+CD25+调节性T细胞 Foxp3 流产

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

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中国生物化学与分子生物学报 2009年第5期25卷 459-464页

作者：葛以跃崔仑标史智扬焦永军张文帅汪华江苏省疾病预防控制中心微生物检验科南京210009

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此... 详细信息

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.

关键词：前S1蛋白结合蛋白蛋白组学葡萄糖调节蛋白75

弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4^+CD25^+Foxp3^+T细胞和NK细胞的影响

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中国血吸虫病防治杂志 2011年第3期23卷 301-306页

作者：焦玉萌章黎葛以跃梁越进王勇南京医科大学病原生物学系南京210029

目的探讨弓形虫排泄分泌抗原(ESA)对B16F10黑素瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用。方法将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型。采用ESA腹腔注射进行... 详细信息

目的探讨弓形虫排泄分泌抗原(ESA)对B16F10黑素瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用。方法将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型。采用ESA腹腔注射进行干预,将实验小鼠分为4组:PBS组、B16F10组、PBS+ESA组、B16F10+ESA组,分别于ESA干预后2、4、6d取脾,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞占脾细胞的比例;WST-8法检测各组小鼠CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制功能;LDH法检测NK细胞杀伤B16F10功能;观测荷瘤鼠肿瘤体积动态变化。结果 ESA干预4、6d后,荷瘤鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占脾细胞的比例分别为(1.65±0.18)%和(1.56±0.17)%,与荷瘤对照组[分别为(2.47±0.10)%和(2.82±0.12)%]比较差异均有统计学意义(P均<0.05);ESA干预可使CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降。抑制作用以干预后4、6d较明显,抑制率分别为50.03%和50.00%,低于荷瘤对照组的75.03%和78.14%(P均<0.05);荷瘤鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例[(3.58±0.07)%]在ESA干预后6d显著高于荷瘤对照组的(2.61±0.13)%(P<0.05)。同时NK细胞杀伤B16F10细胞功能也增强,不同效靶细胞比(5∶1、10∶1、20∶1)下分别为26.51%、35.25%、60.19%,明显高于荷瘤对照组的16.81%、24.63%、45.62%(P均<0.05);ESA干预后,瘤体出现延缓生长,平均出瘤时间较对照组延迟6d,实验终点荷瘤第35天ESA干预组瘤体体积[(6208.34±443.64)mm3]明显小于荷瘤对照组[(9027.46±1362.01)mm3](P<0.05)。结论弓形虫ESA可通过下调荷瘤鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例并抑制其功能和上调NK细胞比例并增强其杀伤功能,发挥抗肿瘤作用。

关键词：弓形虫排泄分泌抗原 CD4+CD25+Foxp3+T细胞 NK细胞黑素瘤

感染弓形虫小鼠脾脏CD4^+CD25^+T细胞的变化

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第3期25卷 189-192页

作者：葛以跃张改吴江平王勇胡伟谭明娟南京医科大学病原生物学系南京210029 南京市妇幼保健院南京210004

目的观察小鼠感染刚地弓形虫后脾脏CD4+CD25+调节性T细胞的动态变化。方法将28只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,其中3组每鼠腹腔接种弓形虫速殖子悬液200μl(含弓形虫速殖子5×104个/ml),对照组腹腔接种灭菌PBS200μl。分别于弓形虫感染后... 详细信息

目的观察小鼠感染刚地弓形虫后脾脏CD4+CD25+调节性T细胞的动态变化。方法将28只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,其中3组每鼠腹腔接种弓形虫速殖子悬液200μl(含弓形虫速殖子5×104个/ml),对照组腹腔接种灭菌PBS200μl。分别于弓形虫感染后第2、4和6天取脾,制成单个核细胞,用实时荧光定量PCR检测脾CD4+T细胞Foxp3基因表达水平,流式细胞仪检测脾CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例,并对CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+T细胞进行绝对计数。结果感染后第4和6天,小鼠脾脏CD4+T细胞Foxp3mRNA相对表达水平分别为1.89±0.23和1.79±0.24,均显著高于正常水平(1.00±0.12)(P<0.01);CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例从感染后第2天(15.07%±2.73%)开始上调(P<0.05),至感染后第4和6天分别为24.29%±3.19%和19.80%±2.66%,均明显高于正常水平(11.58%±2.04%)(P<0.01);脾脏CD4+T细胞占脾细胞的比例及其绝对数量均从感染后第2天开始降低,至感染后第6天分别降至5.49%±1.71%和(1.71±0.44)×106(P<0.01)。结论弓形虫感染导致小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例上调,而脾脏CD4+T细胞的显著减少是促成比例上调的主要原因。

关键词：刚地弓形虫 CD4^+CD25^+调节性T细胞免疫抑制

重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌

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中国食品卫生杂志 2023年第3期35卷 381-389页

作者：安柏霖苏璇郭悦王祥喜葛以跃朱凤才崔仑标南开大学药学院天津300000 江苏省疾病预防控制中心国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室江苏南京210009 天津国际生物医药联合研究院天津300000 南京医科大学江苏南京210029 中国科学院生物物理所北京100101

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌... 详细信息

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性。结果RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测。检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10 copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应。应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000)。结论RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测。

关键词：重组酶介导的等温扩增技术 CRISPR-Cas13a 腹泻病原菌快速分子检测

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量子点探针在病原微生物检测中的应用进展

中华实验和临床病毒学杂志 2023年第4期37卷 461-468页

作者：杨宁孟子欣蓉赵康辰崔仑标葛以跃南京医科大学公共卫生学院南京210029 江苏省疾病预防控制中心、国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室南京210029

随着对纳米技术的不断研究,应用于各种生物分子检测的纳米传感器层出不穷。作为主要的纳米传感器之一,量子点具有独特的光学性质和粒子特性,将其制备为量子点探针用于病原微生物检测已经获得了广泛的应用。量子点探针作为新兴的荧光标志... 详细信息

随着对纳米技术的不断研究,应用于各种生物分子检测的纳米传感器层出不穷。作为主要的纳米传感器之一,量子点具有独特的光学性质和粒子特性,将其制备为量子点探针用于病原微生物检测已经获得了广泛的应用。量子点探针作为新兴的荧光标志物,拥有其他荧光探针无法比拟的优势,如荧光信号强、光稳定性好、荧光寿命长、斯托克斯位移大等,可以实现对靶标简单、快速、灵敏、特异的检测。本文概述了量子点的基本性质和量子点探针作为检测传感器的应用基础,重点介绍了量子点探针的种类、制备方法、以及近几年来在病原微生物检测中的应用,最后总结了量子点探针作为检测传感器的应用注意事项,并展望了量子点探针在病原微生物检测领域的应用前景。

关键词：量子点探针检测传感器病原微生物