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miR-98通过IKKε调控NF-κB通路在胶质瘤侵袭中的作用及机制研究

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miR-98通过IKKε调控NF-κB通路在胶质瘤侵袭中的作用及机制研究

作者：范阳华南昌大学

学位级别：硕士

目的本研究以不同病理级别的胶质瘤组织和U87、U251脑胶质瘤细胞为实验对象,检测miR-98与IKKε在脑胶质瘤组织及细胞中的表达及其相关性,进一步探讨miR-98介导IKKε/NF-κB通路的调控机制及与脑胶质瘤侵袭性生物学行为的关系,以期为胶... 详细信息

目的本研究以不同病理级别的胶质瘤组织和U87、U251脑胶质瘤细胞为实验对象,检测miR-98与IKKε在脑胶质瘤组织及细胞中的表达及其相关性,进一步探讨miR-98介导IKKε/NF-κB通路的调控机制及与脑胶质瘤侵袭性生物学行为的关系,以期为胶质瘤的防治提供新的思路。方法1.第一步通过Real-Time PCR、Western blot方法检测53例脑胶质瘤标本、10例正常脑组织标本及胶质瘤细胞中的miR-98与IKKε、NF-κB p65的表达水平,初步探究分析miR-98与IKKε、NF-κB在脑胶质瘤组织中表达的相关性。2.第二步采用荧光素酶实验:检测miR-98与IKKε之间的调控关系。3.第三步研究人脑胶质瘤细胞转染miR-98 mimics后对胶质瘤细胞侵袭的影响及IKKε/NF-κB表达的体外研究,并初步探讨其潜在机制。a.采用miR-98 mimics转染U87及U251胶质瘤细胞,采用Real time PCR检测miR-98及IKKε、MMP-9 m RNA的表达,采用Western blot检测IKKε、细胞总NF-κB p65及细胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表达;b.Transwell实验检测转染miR-98 mimics后侵袭能力的改变,划痕实验评价转染miR-98 mimics后细胞迁移能力的改变。4.第四步研究在脑胶质瘤中IKKε及NF-κB p65在miR-98调控中的作用的体外研究,并进一步验证其机制a.pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics共转染U87及U251胶质瘤细胞,Western blot检测IKKε、MMP-9、细胞核中NF-κB p65蛋白的表达情况。采用Real time PCR检测IKKε、MMP-9 m RNA的表达;b.Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力的改变。c.pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共转染U87及U251胶质瘤细胞,Western blot检测细胞核中NF-κB p65蛋白的表达情况;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力的改变。结果1、脑胶质瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表达相关性a.miR-98表达水平与脑胶质瘤组织病理级别呈负相关;IKKε、NF-κB P65表达水平与脑胶质瘤组织病理级别呈正相关。b.miR-98与IKKε表达水平呈密切负相关(r2=0.7223,p<0.05),miR-98与NF-κB P65表达水平呈密切负相关(r2=0.6337,p<0.05);NF-κB P65与IKKε表达水平呈密切正相关(r2=0.6123,p<0.05)2、U251、U87细胞较HEB细胞miR-98表达下降,IKKε表达增高;荧光素酶实验显示:转染miR-98 mimics后,IKKε-WT报告载体的荧光强度受到显著抑制;而IKKε-MUT报告载体的荧光强度基本不变,说明IKKεm RNA的3’UTR上存在miR-98的结合位点,证实IKKε是miR-98下游靶基因。3、转染miR-98 mimics发现:a.上调miR-98能够有效抑制脑胶质瘤侵袭与迁移能力。b.上调miR-98表达能够下调IKKε的表达水平及抑制NF-κB p65从细胞质到细胞核的转座,从而调控NF-κB通路及抑制MMP-9的表达水平,而不影响NF-κB p65在细胞中的总含量。4、转染pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics发现:a.上调IKKε能够恢复因转染miR-98 mimics而降低的脑胶质瘤侵袭与迁移能力;b.上调IKKε能恢复NF-κB p65的转座从而调控NF-κB通路及恢复MMP-9的表达水平。5、转染IKKεsi RNA+miR-98 mimics与IKKεsi RNA+miR-98 inhibitor发现:抑制IKKε表达后miR-98 mimics及miR-98 inhibitor对NF-κB p65的转座及MMP-9的表达无差别。6、转染pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics发现:上调NF-κB p65能够恢复因转染miR-98 mimics而降低的脑胶质瘤侵袭与迁移能力结论miR-98可以通过IKKε基因调控NF-κB通路,影响脑胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力。miR-98在胶质瘤中作为一个抑癌基因并可做为潜在治疗脑胶质瘤的分子靶点。

关键词： miR-98 IKKε NF-κB p65 人脑胶质瘤

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完善垂体疾病数据库建设开展高质量临床研究

协和医学杂志 2020年第3期11卷 339-342页

作者：王任直冯铭范阳华中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院神经外科北京100730

我国人口基数大、患者众多且复杂,但医疗资源分布不均衡,各级医疗机构对垂体疾病的诊治水平亦参差不齐,容易产生诊疗不规范现象甚至误诊、误治。随着医院信息化和互联网技术的发展,可对临床医疗过程中产生的海量数据进行清洗和整合,这... 详细信息

我国人口基数大、患者众多且复杂,但医疗资源分布不均衡,各级医疗机构对垂体疾病的诊治水平亦参差不齐,容易产生诊疗不规范现象甚至误诊、误治。随着医院信息化和互联网技术的发展,可对临床医疗过程中产生的海量数据进行清洗和整合,这为构建和完善垂体疾病数据库提供了可能。我们应充分利用人工智能技术、真实世界研究方法对数据进行深度挖掘、归纳和分析,并结合临床中遇到的问题开展相关临床研究,构建更高效、一致性更佳的临床诊疗辅助解决方案,指导临床医生制定更合理的诊疗决策,以期实现垂体疾病的个体化诊疗。

关键词：垂体疾病数据库临床研究人工智能真实世界研究

靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

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西安交通大学学报（医学版） 2016年第1期37卷 14-20页

作者：范阳华祝新根叶敏华廖长春肖兵汲乾坤郭华吴雷南昌大学第二附属医院神经外科江西南昌330006

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,... 详细信息

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10^(11) TU/L、4×10^(11) TU/L、5×10^(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。

关键词：脑胶质瘤 RWDD3 慢病毒 shRNA

缺氧诱导因子-1α与着丝粒蛋白W在人胶质瘤组织及细胞中表达的相关性

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肿瘤 2014年第11期34卷 1045-1051页

作者：廖长春范阳华肖兵吴雷祝新根南昌大学第二附属医院神经外科江西南昌330006

目的 :探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)在人胶质瘤中表达的相关性。方法 :采用免疫组织化学法分别检测高级别胶质瘤、低级别胶质瘤及瘤旁正常脑组织中HIF-1α和... 详细信息

目的 :探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)在人胶质瘤中表达的相关性。方法 :采用免疫组织化学法分别检测高级别胶质瘤、低级别胶质瘤及瘤旁正常脑组织中HIF-1α和CENP-W的表达水平,并统计学分析蛋白表达水平与胶质瘤临床病理特征的关系,以及两蛋白表达之间的相关性。用氯化钴抑制胶质瘤U251细胞中HIF-1α的分解,然后分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测CENP-W蛋白及m RNA表达的变化。应用特异性小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)技术下调U251细胞的HIF-1α表达后,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测CENP-W蛋白及m RNA表达的变化。应用特异性si RNA下调U251细胞中CENP-W表达后,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测HIF-1α蛋白及m RNA表达的变化。结果:胶质瘤组织中HIF-1α和CENP-W的表达水平明显高于癌旁正常组织(P0.05)。结论:HIF-1α和CENP-W表达均与胶质瘤的病理级别呈正相关性。HIF-1α可以调节CENP-W的表达。

关键词：神经胶质瘤缺氧诱导因子1,α亚基着丝粒蛋白W RNA 小分子干扰

粘合连接相关蛋白1在脑胶质瘤中的研究现状及进展

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肿瘤防治研究 2015年第9期42卷 920-923页

作者：范阳华叶敏华祝新根南昌大学第二附属医院神经外科南昌330006 南昌大学医学院研究生院南昌330006

粘合连接相关蛋白1(adherens junction associated protein-1,AJAP1),也称为SHREW1,最初发现是在上皮细胞粘合连接有关的一种新奇的跨膜蛋白,位于染色体1p36.32区域。大量的人类癌症病例研究证明,1p36是一个突变热点,在肿瘤发生过程中,... 详细信息

粘合连接相关蛋白1(adherens junction associated protein-1,AJAP1),也称为SHREW1,最初发现是在上皮细胞粘合连接有关的一种新奇的跨膜蛋白,位于染色体1p36.32区域。大量的人类癌症病例研究证明,1p36是一个突变热点,在肿瘤发生过程中,肿瘤抑制功能的丧失与1p36区域有关。脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,研究显示AJAP1缺失与脑胶质瘤进展有重要关系。在胶质瘤中,AJAP1能够与β-连环蛋白(β-catenin)结合,易位至细胞核内,调节基因转录,影响细胞周期、凋亡及改变细胞骨架结构和细胞极性,抑制细胞的运动及迁移。AJAP1可能是胶质瘤重要的抑制相关靶点,与胶质瘤的发生发展、增殖、凋亡、侵袭及迁移及预后密切相关,但其机制尚未明确。本文就胶质瘤中AJAP1的研究现状及进展进行综述。

关键词：粘合连接相关蛋白1 胶质瘤甲基化 β-catenin 细胞骨架

脑胶质瘤中miR-98的表达及miR-98下调对脑胶质瘤细胞侵袭的促进作用

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肿瘤 2016年第10期36卷 1156-1164页

作者：范阳华祝新根吕世刚叶敏华吴雷高子云南昌大学第二附属医院神经外科江西南昌330006

目的:探讨微RNA(microRNA,miRNA,miR)-98在脑胶质瘤组织中的表达及其对脑胶质瘤U251细胞迁移和侵袭的影响。方法:应用实时荧光定量PCR法检测脑胶质瘤组织和正常脑组织中miR-98的表达。miR-98 inhibitor与野生型核因子κB抑制蛋白激酶ε(... 详细信息

目的:探讨微RNA(microRNA,miRNA,miR)-98在脑胶质瘤组织中的表达及其对脑胶质瘤U251细胞迁移和侵袭的影响。方法:应用实时荧光定量PCR法检测脑胶质瘤组织和正常脑组织中miR-98的表达。miR-98 inhibitor与野生型核因子κB抑制蛋白激酶ε(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase epsilon,IKBKE)3’-端非编码区(untranslated region,UTR)或突变型IKBKE 3’-UTR重组载体共转染后,应用萤光素酶基因报告系统检测miR-98是否与IKBKE基因3’UTR结合。miR-98 inhibitor转染脑胶质瘤U251细胞后,应用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测细胞中miR-98、IKBKE mRNA和IKBKE蛋白的表达,Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力。IKBKE si RNA转染U251细胞后,应用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-98的表达。结果 :脑胶质瘤组织中miR-98的表达水平明显低于正常脑组织(P0.05)。结论 :脑胶质瘤组织中miR-98低表达,miR-98 inhibitor可能通过调控IKBKE而促进脑胶质瘤U251细胞的迁移及侵袭。

关键词：神经胶质瘤微RNAs 细胞迁移分析肿瘤浸润

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人工智能技术在垂体腺瘤诊治中的应用

中国现代神经疾病杂志 2020年第3期20卷 148-152页

作者：张文泰范阳华王贺王任直中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院神经外科垂体腺瘤外科治疗中心 100730

既往对垂体腺瘤诊治方案的选择主要基于神经外科医师的临床经验,因此患者预后主要取决于医师的诊疗水平。近年随着机器学习、影像组学等人工智能技术的发展与进步,临床医师可借助机器辅助诊断、制定治疗方案,从而达到更为一致性的诊断... 详细信息

既往对垂体腺瘤诊治方案的选择主要基于神经外科医师的临床经验,因此患者预后主要取决于医师的诊疗水平。近年随着机器学习、影像组学等人工智能技术的发展与进步,临床医师可借助机器辅助诊断、制定治疗方案,从而达到更为一致性的诊断准确性和更好的疗效。本文对人工智能技术在垂体腺瘤诊治中的应用进行综述,以为临床医师了解人工智能的各种研究方法提供参考,并能全面衡量其利弊,在医学研究中合理使用。

关键词：垂体肿瘤人工智能机器学习综述

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630例面肌痉挛微血管减压术治疗体会

中华神经医学杂志 2016年第7期15卷 739-741页

作者：汲乾坤吴雷祝新根范阳华郭华南昌大学第二附属医院神经外科南昌330006

目的分析微血管减压术治疗面肌痉挛的临床疗效。方法回顾性分析自2008年1月至2014年3月南昌大学第二附属医院神经外科行微血管减压手术治疗的630例面肌痉挛患者的临床资料，其中包括16例二次手术患者；记录术后效果及并发症，并分析其... 详细信息

目的分析微血管减压术治疗面肌痉挛的临床疗效。方法回顾性分析自2008年1月至2014年3月南昌大学第二附属医院神经外科行微血管减压手术治疗的630例面肌痉挛患者的临床资料，其中包括16例二次手术患者；记录术后效果及并发症，并分析其疗效。结果630例患者中579例抽搐完全消失（91．9％），小血管压迫类型患者463例中428例抽搐消失（92．4％），椎．基底动脉复合体压迫患者167例中151例抽搐完全消失（90．4％1。在15例术后无效和21例复发患者中，有16例行二次手术治疗，术后抽搐均完全消失。结论微血管减压术治疗面肌痉挛的疗效确切，术后复发及无效患者二次手术效果明显。

关键词：面肌痉挛微血管减压术小血管压迫椎-基底动脉复合体压迫

沉默CHPF基因表达对人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

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肿瘤 2017年第11期37卷 1136-1144页

作者：尧国军吴淼经江源叶敏华范阳华祝新根南昌大学第二附属医院神经外科江西南昌330006 抚州市第一人民医院神经外科江西抚州344000

目的 :探讨沉默软骨素聚合因子(chondroitin polymerizing factor,CHPF)基因对脑胶质瘤U87细胞增殖及侵袭的影响,及可能的作用机制。方法 :构建携带有靶向CHPF基因sh RNA(CHPF-sh RNA)的重组慢病毒并感染胶质瘤U87细胞。采用实时荧光定... 详细信息

目的 :探讨沉默软骨素聚合因子(chondroitin polymerizing factor,CHPF)基因对脑胶质瘤U87细胞增殖及侵袭的影响,及可能的作用机制。方法 :构建携带有靶向CHPF基因sh RNA(CHPF-sh RNA)的重组慢病毒并感染胶质瘤U87细胞。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测CHPF m RNA及蛋白表达水平的变化,CCK-8法检测细胞的增殖情况,FCM法检测细胞周期及细胞凋亡率,Transwell小室侵袭实验检测U87细胞侵袭能力的变化;蛋白质印迹法检测沉默CHPF基因表达后对单核细胞趋化蛋白1(monoeyte chemoattractant protein 1,MCP-1,又称CCL2)表达水平的影响。最后,采用脂质体法将特异性针对CCL2基因的CCL2-si RNA转入U87细胞,用蛋白质印迹法检测对CHPF蛋白表达的影响。结果 :实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果表明,感染CHPF-sh RNA后U87细胞中CHPF m RNA和蛋白的表达水平均明显被抑制(P值均0.05)。结论:下调CHPF基因表达后,可能通过调控CCL2抑制脑胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力,并促进细胞凋亡。

关键词：神经胶质瘤软骨素聚合因子 RNA,小分子干扰细胞增殖细胞凋亡