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猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用

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猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋...

作者：苏小运南京农业大学

学位级别：硕士

本文利用不同大肠杆菌表达系统(所用表达载体分别为：pThioHisB和pET-32a(+))表达了猪瘟兔化弱毒编码E2蛋白A／D抗原区的基因，并对其表达特性进行了比较。选取含pET-E2HA重组质粒的BL21(DE3)，即BL21E2HA大量表达重组蛋白，通过盐酸胍... 详细信息

本文利用不同大肠杆菌表达系统(所用表达载体分别为：pThioHisB和pET-32a(+))表达了猪瘟兔化弱毒编码E2蛋白A／D抗原区的基因，并对其表达特性进行了比较。选取含pET-E2HA重组质粒的BL21(DE3)，即BL21E2HA大量表达重组蛋白，通过盐酸胍溶解，通过His Bind柱纯化了重组蛋白，定量并以其为包被抗原建立了间接ELISA方法。利用此方法测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平;比较了此方法和间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平的灵敏度。主要实验内容包括： 1．构建了两株重组质粒：pTH-E2和pET-E2，所用表达系统分别为pThioHisB和pET-32a(+)，优化了表达条件并比较了两种质粒的表达特性，发现pET系统在表达此段基因时产量明显优于pThioHisB系统;2．选择pET-E2进行后继工作：将3个串联的HA(人血凝素表位)基因插入到pET-E2重组质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，得到pET-E2HA重组质粒，含有此质粒的BL21(DE3)命名为BL21E2HA，并将其成功的表达;3．利用BL21E2HA大量表达重组蛋白，将细菌裂解，超声波破碎、离心分离包涵体，盐酸胍溶解后过His Bind柱，纯化了重组蛋白;4．利用BSA制备标准曲线，并对处于不可溶状态的纯化后重组蛋白进行了定量。在此基础上，用其作包被抗原建立了间接ELISA方法;利用此间接ELISA方法，测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平，发现经囊素共同免疫后，猪瘟抗体水平有明显提高，这从另一方面证明，该方法具有一定的实用价值，可以进行猪瘟抗体水平的测定;5．比较了间接ELISA方法和现有的间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平时的灵敏度，发现该方法明显优于后者。 6．构建了一个用以检测在细胞培养上猪瘟病毒粒子存在的重组质粒。

关键词：猪瘟兔化弱毒原核表达 E2 A/D抗原区间接ELISA

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鸭传染性浆膜炎的研究历史及现状

畜牧与兽医 2001年第2期33卷 38-40页

作者：苏小运蔡家利西南农业大学动物科技学院重庆400716

鸭传染性浆膜炎已日益困扰着中国的养鸭业。本文追溯了国内外对其的研究历史并结合研究现状 ,对此病的各方面特征进行了较为详细地评述。

关键词：鸭传染性浆膜炎鸭疫里化杆菌血清型流行病学病理变化诊断防制

DNA双链区的切割导致碱变性超螺旋质粒pBR322的分子内结节（英文）

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生物化学与生物物理进展 2016年第8期43卷 778-786页

作者：田磊苏小运张臻峰黄熙泰中国人民解放军海军总医院普外科北京100048 中国农业科学院饲料研究所北京100081 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 南开大学生命科学学院天津300071

为进一步研究碱变性超螺旋D NA(Ⅳ型D NA;DNAⅣ)的结构,对碱变性质粒p BR322进行了酶学分析并利用原子力显微镜(AFM)对新形成的D NA结构进行了观察和比较.在所有已检测的限制酶中只有PstⅠ可以切割质粒p BR322的Ⅳ型DNA分子,说明在这种... 详细信息

为进一步研究碱变性超螺旋D NA(Ⅳ型D NA;DNAⅣ)的结构,对碱变性质粒p BR322进行了酶学分析并利用原子力显微镜(AFM)对新形成的D NA结构进行了观察和比较.在所有已检测的限制酶中只有PstⅠ可以切割质粒p BR322的Ⅳ型DNA分子,说明在这种变性的DNA分子中仍存在少数完整的限制酶识别位点.与碱变性DNA分子的闭合环状结构相反,AFM成像的结果显示PstⅠ处理后的DNAⅣ分子均为开放结构,同时这种分子包含明显的DNA结节.与DNAⅣ分子相比,这种D NA分子的表观长度缩短了大约11%.有意思的是,大肠杆菌拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)也可以在p BR322 DNAⅣ分子中引入分子内结节,而这种结节D NA分子仍然保持闭合状态.AFM的结果表明上述两种结节的DNA分子在表观长度及结节结构的尺寸上均比较相似.这些发现证实,在碱变性的超螺旋DNA分子中仍然保留着一些长度较短的、含有特异性碱基配对的D NA双链区,而在这些区域内的D NA双链断裂可以导致D NA结节.

关键词： DNAⅣ 限制性内切酶 DNA拓扑异构酶 DNA结节原子力显微镜

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瘤胃细菌GH48家族糖苷水解酶基因多样性

微生物学报 2014年第1期54卷 53-61页

作者：李劲亭苏小运田彦董志扬胡松年黄力戴欣中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100101 中国科学院北京基因组研究所北京100101

【目的】了解瘤胃细菌第48家族糖苷水解酶基因(GH48)多样性,为木质纤维素高效降解提供新的基因资源。【方法】通过基因序列比对,设计gh48的简并引物;同时提取两个瘤胃样品的总DNA和总RNA,并将总RNA逆转录成cDNA。以总DNA和cDNA为模板,通... 详细信息

【目的】了解瘤胃细菌第48家族糖苷水解酶基因(GH48)多样性,为木质纤维素高效降解提供新的基因资源。【方法】通过基因序列比对,设计gh48的简并引物;同时提取两个瘤胃样品的总DNA和总RNA,并将总RNA逆转录成cDNA。以总DNA和cDNA为模板,通过PCR扩增分别建立克隆文库并对克隆文库进行测序;对所得序列进行out种类划分和聚类分析。【结果】本研究共得到了455条编码GH48家族蛋白的基因序列,核苷酸序列之间的相似性为58.65%-100%。对序列的进一步分析表明,89%可以作为区分其种类的界定标准。以此为依据确定所得到的基因序列分别编码66种不同的GH48家族蛋白,分别聚为5个相对独立的类群,其中新类群C中OTU65所代表的序列是cDNA克隆文库中的优势序列,分别占两个cDNA克隆文库的36.4%和19.5%。我们的结果揭示瘤胃细菌gh48基因具有丰富的多样性,同时,其中也存在优势表达的GH48家族蛋白。

关键词：瘤胃细菌木质纤维素降解 GH48 糖苷水解酶多样性

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鸡法氏囊提取物的组分分析及其活性测定

南京农业大学学报 2002年第4期25卷 81-83页

作者：缪德年樊生超姚惠娟苏小运陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京21009 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106

应用薄层层析技术分析鸡法氏囊提取物的组分 ,并用体内和体外免疫试验测定其活性。实验结果表明 ,相对分子质量为 10 0 0以下的鸡法氏囊提取物中共有 9种成分的氨基酸或小肽 ,其中第 3组分与囊素标准品具有相同的迁移率(0 6 9)。适当... 详细信息

应用薄层层析技术分析鸡法氏囊提取物的组分 ,并用体内和体外免疫试验测定其活性。实验结果表明 ,相对分子质量为 10 0 0以下的鸡法氏囊提取物中共有 9种成分的氨基酸或小肽 ,其中第 3组分与囊素标准品具有相同的迁移率(0 6 9)。适当浓度的囊素和法氏囊提取物均能促进杂交瘤细胞分泌抗体 ,与对照组相比差异显著 (P <0 0 5 ) ;2 5mg·mL-1提取物具有相当于 1μg·mL-1囊素的促杂交瘤细胞抗体分泌活性。法氏囊提取物与猪瘟疫苗同时注射 ,可显著提高接种猪产生特异性抗体的能力。

关键词：鸡法氏囊提取物组分分析活性测定

生长抑素和耐热木聚糖酶的融合表达及性质研究

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生物技术通报 2020年第9期36卷 235-243页

作者：黄坤龙苏小运姚斌中国农业科学院饲料研究所农业部饲料生物技术重点开放实验室北京100081

旨在获得具有抗原性和免疫原性的融合蛋白CbXyn10C-SS,并对其进行高效表达和酶学性质分析。生长抑素(Somatostatin,SS)从多途径阻碍饲料转化效率和动物生长,使用SS免疫动物可避免其抑制作用。然而SS免疫的研究多以DNA疫苗为载体,少见重... 详细信息

旨在获得具有抗原性和免疫原性的融合蛋白CbXyn10C-SS,并对其进行高效表达和酶学性质分析。生长抑素(Somatostatin,SS)从多途径阻碍饲料转化效率和动物生长,使用SS免疫动物可避免其抑制作用。然而SS免疫的研究多以DNA疫苗为载体,少见重组功能性SS蛋白的高效制备方法。木聚糖酶提高饲料转化率并在饲料中广泛应用,且微生物法发酵制备重组木聚糖酶技术已经非常成熟。将SS基因连接在细菌Caldicellulosiruptor bescii来源的耐热木聚糖酶基因CbXyn10C的3'端进行融合表达。融合蛋白CbXyn10C-SS具有抗原性和免疫原性,且该蛋白的理化性质和催化常数与CbXyn10C非常相似,具高度的热稳定性和较强的催化性能,适合饲料制粒。成功高效表达了能同时作为饲用木聚糖酶和生长抑素抗原的融合蛋白CbXyn10C-SS。

关键词：生长抑素木聚糖酶融合表达抗原表位

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低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

中国农业科技导报 2020年第12期22卷 50-57页

作者：刘杜娟黄火清苏小运中国农业科学院饲料研究所农业农村部饲料生物技术重点开放实验室北京100081

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISP... 详细信息

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1,远高于以出发菌株(高纤维素酶背景)为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活(两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1)。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。

关键词：里氏木霉 CRISPR/Cas9 RNAi 纤维素酶 CBH1 EG2

信号转导抑制剂对囊素刺激杂交瘤细胞抗体分泌及其mRNA表达的影响

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南京农业大学学报 2003年第4期26卷 73-77页

作者：缪德年苏小运姚惠娟樊生超陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106

以杂交瘤细胞为模型 ,在培养液中加入不同的信号转导抑制剂和囊素 ,用间接ELISA法测定抗体分泌水平 ,用定量RT PCR法检测抗体mRNA的表达水平。结果表明 ,加入Gα 蛋白选择性抑制剂NF 0 2 3、蛋白激酶C抑制剂GF10 92 0 3X、磷脂酰肌醇 ... 详细信息

以杂交瘤细胞为模型 ,在培养液中加入不同的信号转导抑制剂和囊素 ,用间接ELISA法测定抗体分泌水平 ,用定量RT PCR法检测抗体mRNA的表达水平。结果表明 ,加入Gα 蛋白选择性抑制剂NF 0 2 3、蛋白激酶C抑制剂GF10 92 0 3X、磷脂酰肌醇 3激酶抑制剂heparin、Ca2 + /calmodulin依赖蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN 6 2、磷脂酶C抑制剂U 7312 2和蛋白激酶G抑制剂后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响明显 (P 0 0 5 ) ,这 3种抑制剂对杂交瘤细胞抗体分泌速度的抑制率分别为 74 5 5 % ,91 13%和80 6 9%。加入 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、genistein和PD 980 5 9后 ,囊素处理组与对照组γ1mRNA的表达水平差异不显著 (P >0 0 5 ) ,说明这 3种抑制剂阻断了囊素刺激的杂交瘤细胞抗体mRNA的表达。以上结果表明 ,蛋白激酶A、酪氨酸蛋白激酶和丝裂原活化的蛋白激酶参与了囊素在杂交瘤细胞中的信号转导。

关键词：信号转导抑制剂杂交瘤细胞囊素间接ELISA法抗体分泌 mRNA表达生物活性因子

嗜热厌氧细菌Caldicellulosiruptor bescii降解木质纤维素研究进展

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生物技术通报 2017年第10期33卷 33-39页

作者：储引娣苏小运中国农业科学院饲料研究所北京100081

嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor bescii具有强大的木质纤维素降解能力,能以多种模式植物细胞壁多糖如微晶纤维素Avicel和木聚糖,甚至未经预处理的木质纤维素如柳枝稷作为唯一碳源快速生长,该菌还具有少见的厌氧降解木质素的能力。对基... 详细信息

嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor bescii具有强大的木质纤维素降解能力,能以多种模式植物细胞壁多糖如微晶纤维素Avicel和木聚糖,甚至未经预处理的木质纤维素如柳枝稷作为唯一碳源快速生长,该菌还具有少见的厌氧降解木质素的能力。对基因组注释发现,该菌所编码的蛋白大多为多结构域双功能酶,即在多肽链的N端和C端分别是不同家族的糖苷水解酶,间隔以2-3个碳水化合物结合结构域。该菌降解纤维素相关的酶基因多集中于一个植物细胞壁多糖降解利用的基因簇,例如纤维素酶/木聚糖酶、纤维素酶/甘露聚糖酶和纤维素酶/木葡聚糖酶等。***的木聚糖酶主要属于GH10家族,该家族的酶底物特异性较为宽泛,氨基酸序列的同源性在18.7%-59.5%间。Caldicellulosiruptor属细菌进化出了一系列的机制使得糖苷水解酶和底物、细菌和木质纤维素能更好的吸附在一起,从而有利于木质纤维素的酶解。***有12个含SLH结构域的蛋白,以及新发现的黏附蛋白Tāpirin,可能参与了木质纤维素的吸附与利用。综述了近年来对***降解植物细胞壁的糖苷水解酶的基因资源挖掘方面和降解分子机制方面的研究进展,对高效、多功能高效木质纤维素降解酶的设计和优化具有积极的意义。

关键词：木质纤维素嗜热厌氧菌糖苷水解酶生物燃料