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利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

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南方医科大学学报 2019年第3期39卷 320-327页

作者：周燕霞胡韦维张虹洋邹琳张鹏辉重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室重庆400014

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-s... 详细信息

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础。

关键词： G6PD CRISPR/Cas9 基因敲除 HEK293T细胞

重庆某三甲医院2014-2016年铜绿假单胞菌耐药表型及金属酶、外膜孔蛋白耐药基因型分析

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第三军医大学学报 2017年第22期39卷 2200-2205页

作者：李进胡韦维张峰领陈鸣邓少丽鲁卫平第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科重庆400042 重庆医科大学附属儿童医院检验科重庆400014

目的检测亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶基因分布和外膜孔蛋白OprD2基因缺失情况,了解铜绿假单胞菌的耐药状况。方法收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所2014-2016年临床分离的非重复铜绿假单胞菌1 887株,VITEK-MS质谱仪进行菌株鉴... 详细信息

目的检测亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶基因分布和外膜孔蛋白OprD2基因缺失情况,了解铜绿假单胞菌的耐药状况。方法收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所2014-2016年临床分离的非重复铜绿假单胞菌1 887株,VITEK-MS质谱仪进行菌株鉴定,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)法测定其对10种常用抗菌药物的敏感性,利用WHONET5.6软件对药敏资料进行统计分析,同时采用亚胺培南-EDTA纸片法筛选金属酶表型阳性的菌株,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)测铜绿假单胞菌金属β-内酰酶(metallo-β-lactamase,MBL)相关基因(IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM)和外膜孔蛋白OprD2基因的情况。结果 3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为756株(9.4%)、579株(9.5%)和552株(10.7%),主要来自ICU病房和呼吸内科病房,标本类型以痰液为主;2014-2016年分离出的铜绿假单胞菌对妥布霉素、庆大霉素的耐药率逐年下降,其耐药率分别从2014年的11.3%、13.2%下降至2016年的7.8%、9.0%,对左旋氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率呈上升趋势,其耐药率从2014年的10.7%、9.2%上升至2016年的23.5%、11.6%。从基因型分布情况来看,269株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中MBL基因阳性51株(18.9%),外膜孔蛋白OprD2缺失158株(58.7%);51株产酶菌株中VIM型阳性29株,SPM型阳性22株,未检测出其他基因型。结论铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率较高;产MBL和外膜孔蛋白OprD2基因缺失是引起铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。

关键词：铜绿假单胞菌耐药性金属酶外膜孔蛋白OprD2基因

诱导多能干细胞在遗传性血液病中的应用与前景

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检验医学与临床 2018年第18期15卷 2826-2828,2835页

作者：刘益胡韦维张鹏辉重庆医科大学附属儿童医院检验科 400014

异基因造血干细胞移植（HSCT）是目前根治遗传性、恶性血液系统疾病的最重要的手段,然而配型成功率低、易发生急性移植物抗宿主病严重限制了其在临床治疗中的广泛应用。诱导多能干细胞（iPSCs）具有细胞来源广、可直接从患者自身获得、... 详细信息

异基因造血干细胞移植（HSCT）是目前根治遗传性、恶性血液系统疾病的最重要的手段,然而配型成功率低、易发生急性移植物抗宿主病严重限制了其在临床治疗中的广泛应用。诱导多能干细胞（iPSCs）具有细胞来源广、可直接从患者自身获得、在体外可诱导分化为造血祖细胞的优点。随着基因编辑技术不断发展,靶向修复患者iPSCs从而治疗遗传疾病已成为可能。

关键词：诱导多能干细胞遗传性血液病基因编辑

多重耐药铜绿假单胞菌的两种同源性分析方法的比较

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第三军医大学学报 2018年第14期40卷 1258-1262页

作者：李进胡韦维张峰领黎敏陈鸣邓少丽鲁卫平陆军军医大学(第三军医大学)第三附属医院(野战外科研究所)检验科重庆400042 重庆医科大学附属儿童医院检验科重庆400014

目的以脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)为金标准,评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在多重耐药铜绿假单胞菌(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDR-PA)同源性分析中应用的可行性。方法收集陆军军医大学第三附属医院2017年1-12月重症监护病房住院患者分离的20株MDR-PA非重复菌株,利用VITEK MS SARAMIS软件对MDR-PA蛋白图谱进行聚类分析,同时对其进行PFGE同源性分析,并将两种方法所得的分型结果进行对比分析。结果 MALDITOF MS同源性分析结果与PFGE同源性分析结果比较显示,20株MDR-PA通过MALDI-TOF MS聚类分析将其分为三大簇(Ⅰ型13株,Ⅱ型6株,Ⅲ型1株),而依据PFGE分型结果则将其分为6种亚型(A型2株,B型3株,C型4株,D型3株,E型7株,F型1株),其中有C型和E型中具有相同基因型菌株间,其MALDI-TOF MS亲缘性关系也较近,而其余4种亚型菌株间亲缘性比较,发现PFGE分型结果与MALDI-TOF MS聚类分析结果不完全相符。结论与PFGE同源性分析相比,MALDI-TOF MS同源性分析结果一致性不稳定,具有一定局限性,尚不能取代PFGE同源性分析。

关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱脉冲场凝胶电泳多重耐药铜绿假单胞菌同源性分析

应用多色探针熔解曲线法检测G6PD缺乏症杂合子的基因突变

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第三军医大学学报 2018年第9期40卷 830-835页

作者：胡韦维李进刘益刘之岱张娟余朝文邹琳张鹏辉重庆医科大学附属儿童医院检验科儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地重庆市干细胞治疗工程技术研究中心重庆400014 陆军军医大学(第三军医大学)第三附属医院(野战外科研究所)检验科重庆400042 重庆医科大学附属儿童医院临床分子医学中心重庆400014

目的应用多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA),建立一种快速筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症杂合子的临床方法。方法收集重庆地区2015年1月至2016年7月共429例(男性342例,女性87例)疑似G6PD缺乏症的患者... 详细信息

目的应用多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA),建立一种快速筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症杂合子的临床方法。方法收集重庆地区2015年1月至2016年7月共429例(男性342例,女性87例)疑似G6PD缺乏症的患者外周血,采用G6PD/6PGD定量比值法和MMCA法分别检测男性和女性G6PD酶活性和基因突变,以金标准Sanger测序来评价两种方法。同时收集重庆地区进行G6PD缺乏症新生儿疾病筛查的1 754份女性末梢血滤纸片,采用MMCA法筛查G6PD基因突变。结果 429例疑似病例中,G6PD/6PGD定量比值法诊断男性的灵敏度96.8%、特异性100%,与Sanger测序法一致性好(Kappa=0.917,P<0.05);但女性的灵敏度仅10%,特异性100%,与Sanger测序法一致性差(Kappa=0.127,P<0.05)。MMCA法诊断男性的灵敏度95.7%,特异性100%,与Sanger测序法一致性较好(Kappa=0.891,P<0.05);女性的灵敏度100%,特异性100%,与Sanger测序法结果完全吻合(Kappa=1.000,P<0.05)。1 754例女性中杂合子占1.14%(20/1 754),G6PD酶活性均正常。结论与传统的G6PD/6PGD定量比值法比较,MMCA法检测杂合子灵敏度更高,可用于G6PD缺乏症杂合子筛查,为一种简便、准确的诊断新方法。

关键词：多色探针熔解曲线分析法 G6PD缺乏症杂合子基因诊断

Carba plus纸片法检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的性能评估

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中华医院感染学杂志 2020年第1期30卷 34-39页

作者：李进黎敏邓少丽黄庆鲁卫平刘雯瑜张策胡韦维陆军军医大学大坪医院检验科重庆400042 陆军军医大学基础医学院重庆400038 重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科重庆400016

目的评估Carba plus纸片法检测碳青霉烯酶类型的能力和临床价值。方法收集陆军军医大学大坪医院2017年1月-2017年12月临床分离的77株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)为实验组,同时选取84株碳青... 详细信息

目的评估Carba plus纸片法检测碳青霉烯酶类型的能力和临床价值。方法收集陆军军医大学大坪医院2017年1月-2017年12月临床分离的77株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)为实验组,同时选取84株碳青霉烯敏感肠杆菌科细菌(carbapenem-sensitive Enterobacteriaceae,CSE)作为对照组,所有菌株进行耐药基因检测和Carba plus纸片法检测,以耐药基因检测结果作为碳青霉烯酶类型的金标准,同时对Carba plus纸片法检测碳青霉烯酶类型的相关性能指标进行统计分析。结果 77株CRE中经耐药基因序列分析结果KPC阳性51株,MBL阳性22株,OXA-48阳性4株。Carba plus纸片法检测结果KPC阳性42株,MBL阳性26株,OXA-48阳性5株,其余4株未检测出产酶基因型。Carba plus纸片法预测KPC酶的灵敏度为82.3%,特异度为100.0%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为92.4%,准确度为94.4%;预测MBL酶阳性的灵敏度为100.0%,特异度为97.1%,阳性预测值为84.6%,阴性预测值为100.0%,准确度为97.5%;预测产OXA-48酶的灵敏度为100.0%,特异度为99.4%,阳性预测值为80.0%,阴性预测值为100.0%,准确度为99.4%。结论 Carba plus纸片法对CRE菌株产酶类型可进行快速、准确、便捷地鉴定,在基层微生物实验室有很大的发展前景,可作为表型确认试验和耐药监测的一种主要手段。

关键词：肠杆菌科细菌碳青霉烯酶 Carba plus纸片法

重庆市某三甲医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药特征及耐药基因的流行情况

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广西医科大学学报 2019年第11期36卷 1756-1760页

作者：李进胡韦维黎敏邓少丽黄庆鲁卫平中国人民解放军陆军特色医学中心检验科重庆400042 重庆医科大学附属第一医院呼吸与重症医学科重庆400016

目的:了解重庆市某三甲医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的耐药特征及耐药基因的流行情况,为探讨CRE菌株的分子生物学特征提供监测依据。方法:收集重庆市某三甲医院2018年1—12月临床分离的61株CRE菌株,利用VITEK-MS质谱仪对所有菌株... 详细信息

目的:了解重庆市某三甲医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的耐药特征及耐药基因的流行情况,为探讨CRE菌株的分子生物学特征提供监测依据。方法:收集重庆市某三甲医院2018年1—12月临床分离的61株CRE菌株,利用VITEK-MS质谱仪对所有菌株进行鉴定,并通过VITEK-2 Compact系统检测其对14种临床常用抗生素的耐药率,利用WHONET 5.6软件对61株CRE菌株的药敏资料进行统计分析,同时采用聚合酶链反应(PCR)对61株CRE菌株碳青霉烯酶基因(bla KPC-2、bla IMP-1、bla VIM-2、bla NDM-1和bla OXA-48)分布情况进行分析。结果:61株CRE菌株中共检测出肺炎克雷伯菌51株(83.6%)、阴沟肠杆菌6株(9.8%)、大肠埃希菌4株(6.6%);药敏结果显示:61株CRE菌株对临床常用抗生素呈高度耐药,除了对左旋氧氟沙星和阿米卡星的耐药率低于60%,其余大部分抗生素的耐药率都大于80%;61株CRE菌株共检测出bla KPC-2基因型50株,bla NDM-1基因型9株,bla OXA-48基因型4株,未检测出bla IMP-1基因型和bla VIM-2基因型。结论:医院患者感染CRE菌株后对多种抗生素的耐药率较高,临床微生物实验室及感染控制中心应加强对CRE菌株的监测,临床医生应根据CRE菌株药敏结果合理选用抗菌药物。

关键词：耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药特征耐药基因

全程供应链管理服务模式下象屿集团供应链成本管理研究

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全程供应链管理服务模式下象屿集团供应链成本管理研究

作者：韦维兰州财经大学

学位级别：硕士

安胃汤含药血清抑制MC细胞PD-1/PD-L1信号轴细胞免疫逃逸机制研究

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时珍国医国药 2024年第4期35卷 827-831页

作者：陈丽谭程匀韦维广西中医药大学广西南宁530200

目的探讨安胃汤含药血清对MC细胞PD-1/PD-L1信号通路相关因子及免疫逃逸影响。方法以MC细胞为研究对象,设立空白组、安胃汤组、安胃汤^(+)阻断剂组、阻断剂组;CCK8检测12h、24h、48h细胞增殖情况,确定最佳检测时间点及含药血清比例;检... 详细信息

目的探讨安胃汤含药血清对MC细胞PD-1/PD-L1信号通路相关因子及免疫逃逸影响。方法以MC细胞为研究对象,设立空白组、安胃汤组、安胃汤^(+)阻断剂组、阻断剂组;CCK8检测12h、24h、48h细胞增殖情况,确定最佳检测时间点及含药血清比例;检测各组细胞上清液LDH活性;AO-EB染色法检测细胞膜的完整性;ELISA检测CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平;Real-time PCR和Western-blot检测PD-1、PD-L1蛋白和基因的表达。结果选用48h时间点、10%含药血清比例加入后续实验;与其余三组比较,安胃汤组LDH活性增高(P<0.01);给药组AO-EB染色均可见细胞核形态改变;与其余各组比较,安胃汤组CD8^(+)表达下降(P<0.01)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)水平升高(P<0.01);安胃汤组与其余各组比较,PD-1、PD-L1蛋白和基因表达下降(P<0.01,P<0.05)。结论安胃汤能通过降低PD-1、PD-L1、CD8^(+)水平,升高CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)表达,促进细胞凋亡抑制细胞免疫逃逸,从而实现抗CAG作用。

关键词：安胃汤 MC细胞免疫逃逸 PD-1/PD-L1 细胞凋亡