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椒红丸及其组方药物对东莨菪碱诱导阿尔茨海默病小鼠的影响

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中国实验方剂学杂志 2024年第2期30卷 37-45页

作者：董李晋川蔡维艳冯利杨庆李梦婷王艳丽张红李琦翁小刚王娅杰朱晓新胡晓茹陈颖中国中医科学院中药研究所北京100700 国家开放大学医药学院北京100039 中国食品药品检定研究院北京100050

目的:通过药效学和代谢组学研究,探讨椒红丸及组方药物对东莨菪碱诱导阿尔茨海默病(AD)模型小鼠认知功能障碍的改善作用及其机制。方法:以东莨菪碱诱导构建AD模型,选用椒红、地黄、椒红丸分别进行干预,采用旷场、水迷宫、物体识别、避... 详细信息

目的:通过药效学和代谢组学研究,探讨椒红丸及组方药物对东莨菪碱诱导阿尔茨海默病(AD)模型小鼠认知功能障碍的改善作用及其机制。方法:以东莨菪碱诱导构建AD模型,选用椒红、地黄、椒红丸分别进行干预,采用旷场、水迷宫、物体识别、避暗实验检测小鼠认知功能及胆碱能系统和氧化应激相关生化检测,探究椒红丸及其组方药物药效差异;采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC Q-Exactive Orbitrap MS)对小鼠大脑皮层进行非靶向代谢组学分析。结果:行为学数据显示,与模型组比较,椒红丸高剂量、椒红、地黄组小鼠新物体识别实验中辨别指数均明显增加(P<0.05);椒红、地黄及椒红丸高低剂量组小鼠水迷宫实验中登台率明显增加(P<0.05,P<0.01);椒红、椒红丸高低剂量组小鼠穿台次数明显增加(P<0.05,P<0.01);椒红、椒红丸高剂量组小鼠避暗实验错误次数显著降低(P<0.01),椒红丸及其组方药物组小鼠错误潜伏期均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,椒红丸两个剂量组、椒红组小鼠大脑皮层乙酰胆碱转移酶活力明显升高(P<0.05,P<0.01),椒红丸高剂量组乙酰胆碱酯酶活力明显降低(P<0.05),乙酰胆碱水平显著升高(P<0.01),同时椒红丸两个剂量组小鼠血清中丙二醛含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。大脑皮层代谢组学研究结果显示,椒红丸组与模型组共鉴定出差异代谢物149个,涉及神经递质代谢、能量代谢、氧化应激与氨基酸代谢功能。结论:椒红丸及其组方药物可以拮抗东莨菪碱造成的认知功能障碍、调节胆碱能系统、降低氧化应激损伤;其对AD治疗作用机制与调控神经递质、能量、氨基酸代谢,改善氧化应激等作用有关。

关键词：花椒地黄阿尔茨海默病学习记忆代谢组学

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代谢组学在航天医学研究中应用的研究进展

中国实验动物学报 2022年第4期30卷 540-546页

作者：冯利陈颖胡晓茹刘新民国家开放大学医药学院北京100039 中国中医科学院中药研究所北京100700 中国食品药品检定研究院北京100050 中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所北京100193

航天员在航天飞行时暴露于微重力、太空辐射、孤独、噪音、震动、狭小空间等,这些因素会干扰机体的稳态,引发一系列不适症状。深入了解这些因素对机体影响的机制对确保载人航天任务的顺利实施非常重要。本文从Pubmed、CNKI等数据库检索... 详细信息

航天员在航天飞行时暴露于微重力、太空辐射、孤独、噪音、震动、狭小空间等,这些因素会干扰机体的稳态,引发一系列不适症状。深入了解这些因素对机体影响的机制对确保载人航天任务的顺利实施非常重要。本文从Pubmed、CNKI等数据库检索相关文献并总结了航天因素影响人体或实验动物的代谢组学研究以深入了解机体是如何适应航天极端环境以及航天因素对机体影响的分子机制,为制定个体化防护措施,提高航天飞行的安全性提供依据。

关键词：代谢组学航天医学微重力航天飞行因素个性化防护

基于PI3K/Akt信号途径探讨小金丹对巨噬细胞极化的调控作用及机制

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中国实验方剂学杂志 2022年

作者：彭博练东银张广平陈颖侯红平贺蓉李建荣胡晓茹中国中医科学院中药研究所中国食品药品检定研究院

目的：探讨小金丹提取物（Xiaojindan，XJD）对巨噬细胞极化的调控作用及作用机制。方法：以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）刺激RAW264.7细胞诱导M1型和M2型极化。采用细胞计数试剂（CellCoun... 详细信息

目的：探讨小金丹提取物（Xiaojindan，XJD）对巨噬细胞极化的调控作用及作用机制。方法：以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）刺激RAW264.7细胞诱导M1型和M2型极化。采用细胞计数试剂（CellCountingKit-8，CCK-8）法检测10-80mg·L;XJD对RAW264.7细胞增殖活性的影响；采用Griess法检测一氧化氮（nitricoxide，NO）的释放；采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）释放；采用定量聚合酶链式反应（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qPCR）法检测M1型和M2型巨噬细胞标志物的基因表达；采用流式细胞分析法检测CD206表达；westernblot法检测磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途径关键蛋白的活化。结果：10-80mg·L;XJD对0.5mg·L;LPS和20μg·L;IL-4诱导的RAW264.7细胞增殖未见明显影响。同空白组相比，LPS诱导组M1型巨噬细胞标志物表达升高，主要包括显著增加NO、IL-6的释放（P<0.01），明显上调M1型基因白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）、前列腺素氧化环化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）mRNA的表达（P<0.01）。同LPS诱导组相比，20-80mg·L;XJD能剂量依赖性显著抑制NO、IL-6的释放（P<0.01）；10-80mg·L;XJD能剂量依赖性下调M1型基因IL-1β、iNOS、COX-2和TNF-αmRNA的表达（P<0.01）。同空白组相比，IL-4诱导组M2型巨噬细胞标志物表达升高，主要包括CD206;巨噬细胞比例显著升高（P<0.01），明显上调M2型基因精氨酸-1（arginine-1，Arg-1）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白细胞介素-13（interleukin-13，IL-13）和转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β;，TGF-β;)mRNA的表达（P<0.01）。同IL-4诱导组相比，10-80mg·L;XJD能剂量依赖性显著降低CD206;的M2型巨噬细胞比例（P<0.01）；明显下调Arg-1、IL-10、IL-13和TGF-β;mRNA表达（P<0.01）。Westernblot实验显示，同空白组比较，LPS和IL-4诱导组磷脂酰肌醇3激酶p110（PI3K-p110）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）表达均明显上调（P<0.01）；同LPS或IL-4诱导组比较，XJD能明显降低PI3Kp110蛋白表达和Akt磷酸化水平（P<0.05，P<0.01）。结论：小金丹提取物能抑制LPS和IL-4诱导RAW264.7细胞的M1型极化和M2型极化，机制与降低PI3K/Akt通路的活化水平有关。

关键词：小金丹 RAW264.7 巨噬细胞极化 PI3K/Akt信号通路

基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分析乌拉尔甘草与光果甘草化学成分差异

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中国药物警戒 2022年第9期19卷 954-958页

作者：陈佳聂黎行胡晓茹刘薇魏锋马双成中国食品药品检定研究院北京102629

目的识别豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)(俗称“乌拉尔甘草”)与光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)的差异性化学成分,为甘草质量评价提供参考。方法采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)法对乌拉尔甘... 详细信息

目的识别豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)(俗称“乌拉尔甘草”)与光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)的差异性化学成分,为甘草质量评价提供参考。方法采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)法对乌拉尔甘草及光果甘草化学成分进行检测,结合数据分析软件,以主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)对采集的数据进行分析,找出乌拉尔甘草及光果甘草的差异性化合物。采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-TQ-MS/MS)法进一步验证差异性化合物的准确性。结果确定了光甘草定、新甘草苷、光甘草酚等11个化合物是乌拉尔甘草及光果甘草的差异性化学成分。结论乌拉尔甘草与光果甘草部分化学成分存在明显差异,这些差异性化学成分对甘草质量标准制定具有借鉴意义。

关键词：甘草(乌拉尔甘草) 光果甘草超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱超高效液相色谱-三重四极杆质谱主成分分析正交偏最小二乘法差异性化合物

基于PI3K/Akt信号通路探讨小金丹对巨噬细胞极化的调控作用及机制

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中国实验方剂学杂志 2022年第9期28卷 36-42页

作者：彭博练东银张广平陈颖侯红平贺蓉李建荣胡晓茹中国中医科学院中药研究所北京100700 中国食品药品检定研究院北京100050

目的:探讨小金丹提取物(XJD)对巨噬细胞极化的调控作用及作用机制。方法:以脂多糖(LPS)、白细胞介素-4(IL-4)刺激RAW264.7细胞诱导M1型和M2型极化。采用细胞增殖活性检测(CCK-8)法检测10~80 mg·L^(-1)对RAW264.7细胞增殖活性的影响;采... 详细信息

目的:探讨小金丹提取物(XJD)对巨噬细胞极化的调控作用及作用机制。方法:以脂多糖(LPS)、白细胞介素-4(IL-4)刺激RAW264.7细胞诱导M1型和M2型极化。采用细胞增殖活性检测(CCK-8)法检测10~80 mg·L^(-1)对RAW264.7细胞增殖活性的影响;采用Griess法检测一氧化氮(NO)的释放;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞因子白细胞介素-6(IL-6)释放;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测M1型和M2型巨噬细胞标志物的mRNA表达;采用流式细胞分析法检测CD206表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路关键蛋白的活化。结果:10~80 mg·L^(-1)XJD对0.5 mg·L^(-1)LPS和20μg·L^(-1)IL-4诱导的RAW264.7细胞增殖未见明显影响。与空白组比较,LPS诱导组M1型巨噬细胞标志物表达升高,主要包括显著增加NO、IL-6释放(P<0.01),明显上调M1型基因白细胞介素-1β(IL-1β)、一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素氧化环化酶-2(COX-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达(P<0.01)。同LPS诱导组比较,20~80 mg·L^(-1)XJD能浓度依赖性显著抑制NO、IL-6的释放(P<0.01);10~80 mg·L^(-1)XJD能浓度依赖性下调M1型基因IL-1β、iNOS、COX-2和TNF-αmRNA表达(P<0.01)。与空白组比较,IL-4诱导组M2型巨噬细胞标志物表达升高,主要包括CD206+巨噬细胞比例显著升高(P<0.01),显著上调M2型基因精氨酸-1(Arg-1)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-13(IL-13)和转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))mRNA表达(P<0.01)。同IL-4诱导组比较,10~80 mg·L^(-1)XJD能浓度依赖性显著降低CD206+M2型巨噬细胞比例(P<0.01);显著下调Arg-1、IL-10、IL-13和TGF-β_(1)mRNA表达(P<0.01)。Western blot结果显示,与空白组比较,LPS和IL-4诱导组磷脂酰肌醇3-激酶p110(PI3K-p110)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达均显著上调(P<0.01);同LPS或IL-4诱导组比较,XJD能明显降低PI3K p110蛋白表达和p-Akt水平(P<0.05,P<0.01)。结论:小金丹提取物能抑制LPS和IL-4诱导RAW264.7细胞的M1型极化和M2型极化,机制与降低PI3K/Akt通路的活化水平有关。

关键词：小金丹 RAW264.7 巨噬细胞极化磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路

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红花水提部位化学成分研究

中药材 2012年第10期35卷 1616-1619页

作者：李晓锋胡晓茹戴忠张燕梁宏林瑞超上海中医药大学中药研究所上海201203 中国食品药品检定研究院北京100050 太原华卫药业有限公司山西太原030006 山西省食品药品检验所山西太原030001

目的:进一步研究红花水提物中的化学成分。方法:通过大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20反复柱层析及制备HPLC方法分离纯化并通过波谱分析鉴定红花水提物中的化学成分。结果:从红花中分离得到12个化合物,经鉴定分别为:对羟基苯甲醛(1)、反... 详细信息

目的:进一步研究红花水提物中的化学成分。方法:通过大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20反复柱层析及制备HPLC方法分离纯化并通过波谱分析鉴定红花水提物中的化学成分。结果:从红花中分离得到12个化合物,经鉴定分别为:对羟基苯甲醛(1)、反式-1-(4'-羟基苯基)-丁-1-烯-3-酮(2)、3-吲哚甲醛(3)、2-乙酰基-5-羟甲基呋喃(4)、对羟基桂皮酸(5)、(6R,7E,9R)9-hydroxy-4-megastigmandien-3-one(6)、对羟基苯乙酮(7)、5-羟甲基糠醛(8)、对羟基苯甲酸(9)、豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、胡萝卜苷(11)、β-谷甾醇(12)。结论:其中,化合物1～4、6、7、10为首次从该植物中分离得到。

关键词：红花水提部位化学成分结构鉴定

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分散式农村污水生态净化槽的应用研究

分散式农村污水生态净化槽的应用研究

作者：胡晓茹山东农业大学

学位级别：硕士

农村生活污水已成为水环境污染的重要来源之一。目前,虽然人们已经针对农村污水治理开展了大量研究和实践,然所采用的污水处理技术多采用市政污水处理工艺的微型化。农村(尤其是北方丘陵山区)居民居住分散,农村污水难以采用管网集中收... 详细信息

农村生活污水已成为水环境污染的重要来源之一。目前,虽然人们已经针对农村污水治理开展了大量研究和实践,然所采用的污水处理技术多采用市政污水处理工艺的微型化。农村(尤其是北方丘陵山区)居民居住分散,农村污水难以采用管网集中收集而导致治理效率低或成本过高。即便是已经建成农村污水处理站也由于管理和运行维护不到位等原因而多数处于停运或废弃状态。因此,针对我国北方丘陵地区农村生活污水的排放特征,本研究拟研发一种高效低耗、运行稳定、管理简单方便的适用于农村单户污水的分散式污水生态净化槽,系统研究了其处理效果及净化原理,并论证了该处理工艺的经济适用性。为解决我国丘陵山区农村生活污水问题提供一种因地制宜的技术途径。主要结论如下:(1)山东省蒙阴县、新泰市等地农村生活污水的排放方式粗放,以直接排放为主;人均日排水量小(11～50升·(人·天))、时变化系数大(2.27～6.14)、厨房污水和洗漱污水约占总排放量的80～85%;污染物以COD、NH-N和TP为主,重金属等有毒有害和难降解污染物含量低。新泰市、蒙阴县两个地区污水处理设施覆盖率偏低(5.45%、8.68%),现有设施运行维护管理难度较大、运行成本较高,导致运行率低。(2)设置水力停留时间(HRT)分别为24、48和72 h三种工况,研究了分散式农村污水生态净化槽的污水处理效果。在HRT=24 h、温度为20～30℃时,COD、NH-N和TP的去除率分别为80.87%、35.59%和46.02%;经处理后的出水浓度分别为53.96、22.83及2.06 mg·L。其中COD达到山东省《农村生活污水处理处置设施水污染物排放标准》(DB 37/3693-2019)二级标准(COD≤100 mg·L)。本研究也通过水质高负荷冲击(1.5倍)和闲置后重启(10 d)两个方面探讨了该净化槽的运行稳定性,结果表明高负荷冲击和长期闲置均会对净化槽的处理效果产生一定的影响,COD去除率依然维持在50%。(3)为进一步提高生态净化槽的污水净化效能,加设了太阳能曝气设备,结果表明COD、NH-N和TP的去除率较未加设曝气前均有所提高,平均去除率分别达到81.28%、38.83%和58.81%。加设太阳能曝气设备后的污水生态净化槽在冬季低温下出水满足山东省《农村生活污水处理处置设施水污染物排放标准》(DB 37/3693-2019)二级标准。(4)填料吸附是分散式农村污水生态净化槽去除TP的主要机理,静态吸附实验结果表明,腐殖土和陶粒均对TP具有较强的吸附能力,最大吸附量分别为1.41和0.54mg·g。(5)本研究利用高通量测序技术探究并分析分散式农村污水生态净化槽的微生物群落特征。实验结果表明,陶粒中含有的除磷功能菌群较为丰富,其优势菌种为红环菌科(Rhodocyclaceae,6.67%);腐殖土中氨氧化细菌和硝化细菌的含量较高,其优势菌属为硝化螺旋菌属(Nitrospira)等;活性炭和石英砂中反硝化菌群较为丰富,其优势菌属为有假单胞菌属(Pseudomonas)等。加设太阳能曝气后的净化槽最主要优势菌门的变形菌门(Proteobacteria)由未加设曝气时的33.29%～54.51%升至88%左右,主要优势菌属出现动胶菌属(Zoogloea)。本研究通过对分散式农村污水生态净化槽处理模拟农村污水以及性能优化,试验结果表明,该装置对生活污水去除效果稳定,符合农村分散式生活污水处理的实际需求。

关键词：农村生活污水分散式净化槽填料微生物群落

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新型喹诺酮类药物帕珠沙星的合成工艺优化

新型喹诺酮类药物帕珠沙星的合成工艺优化

作者：胡晓茹郑州大学

学位级别：硕士

帕珠沙星是国际市场上刚刚上市不久的第Ⅲ代氟喹诺酮类药物,在国内属于二类新药,具有很大的市场潜力。因此对帕珠沙星的合成工艺进行优化,使其更有利于工业化生产,具有较好的经济效益实有必要。为此本文从以下几个方面进行了研究: ... 详细信息

帕珠沙星是国际市场上刚刚上市不久的第Ⅲ代氟喹诺酮类药物,在国内属于二类新药,具有很大的市场潜力。因此对帕珠沙星的合成工艺进行优化,使其更有利于工业化生产,具有较好的经济效益实有必要。为此本文从以下几个方面进行了研究: 1.以左旋环合酯（（S）-9,10-二氟-3-甲基-2,3-二氢-7-氧代-7-H-吡啶并[1,2,3-de][1,4]苯并噁嗪-6-羧酸乙酯）为起始原料,经亲核取代、脱羧、环丙化、水解和经典Hoffman重排等单元反应,合成出了一种新型喹诺酮类药物—帕珠沙星,并对其合成路线进行了优化,使其总收率达到35.9%。利用红外光谱、质谱和核磁等技术对帕珠沙星及其中间产品进行结构鉴定和分析。 2.采用高效薄层色谱法对第一步亲核反应进程进行监控。利用高效层析硅胶板,以甲醇:氯仿:乙酸乙酯:浓氨水=3:7:0.5:0.5混合溶剂作为展开剂,在平底展开室上行展开,以反应液:甲醇=3:10配制样品,采用光学检出法进行定性分析和定量分析。其结果显示,原料左旋缓合酯的Rf为0.905,亲核取代产物Rf为0.604。 3.重点研究了（S）-10-（氰基乙氧羰基甲基）-9-氟-3-甲基7-氧代-2,3-二氢-7H-吡啶[1,2,3-de][1,4]苯并噁嗪-6-羧酸乙酯的合成。分析了亲核取代反应机理,考察了影响该合成反应的主要因素。并在选用自制催化剂K的条件下,优化出了较佳合成工艺条件具体（以0.005mol环合物计）为:反应温度55℃,加料温度55℃,反应时间6.25h,物料比为左旋环合酯:氰乙酸乙酯:催化剂K=1:6.94:5.94,溶剂量为14ml。 4.在优化条件下,做了两次平行实验,其目的产物的收率分别为90.78%和90.50%,重复较性好。与文献值相比,其收率提高了5%左右。研究结果表明,经过优化后的合成工艺不仅操作简便,而且总收率也有所提高,为帕珠沙星的工业化生产奠定了基础。

关键词：喹诺酮类药物帕珠沙星催化合成

NOD2在高糖诱导的肾小球内皮细胞间充质转分化中的作用及机制

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NOD2在高糖诱导的肾小球内皮细胞间充质转分化中的作用及机制

作者：胡晓茹郑州大学

学位级别：硕士

背景糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最主要的微血管病变之一,病程早期出现肾小球高滤过,而后出现微量白蛋白尿、大量蛋白尿及进行性肾功能减退,最终发展成为终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）。近年来细胞和... 详细信息

背景糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最主要的微血管病变之一,病程早期出现肾小球高滤过,而后出现微量白蛋白尿、大量蛋白尿及进行性肾功能减退,最终发展成为终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）。近年来细胞和分子水平的研究提出了许多糖尿病肾病的病理机制,主要包括血流动力学改变、炎症反应、氧化应激、蛋白激酶C活化、糖基化终末产物生成增多、维生素D受体表达减少、足细胞损伤、内皮细胞损伤等。肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cells,GEnCs）构成肾小球滤过膜的内层,维持肾小球滤过膜的完整性,对于阻止尿蛋白漏出、维持正常肾功能均具有重要的意义。高血糖可引起GEnCs损伤,表现为内皮通透性增加、舒缩功能障碍及黏附因子表达上调等,导致蛋白尿和肾功能受损。据报道,高糖诱导下GEnCs可发生表型转变,表现为内皮细胞表型缺失同时出现间充质细胞表型,此转换被称为内皮细胞间充质转分化（endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT）。近年来,有学者认为糖尿病肾病可能由高血糖激活固有免疫应答引起。高糖诱导下,固有免疫细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）家族中的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2）被激活,引起固有免疫应答,导致糖尿病肾病的进展。目前关于NOD2在内皮细胞损伤中的作用尚未见报道,探讨NOD2是否参与高糖诱导的GEnCs EndMT对DN发病机制的理解及临床治疗具有重要意义。目的在此研究中,我们培养小鼠GEnCs的条件永生化细胞系,用高糖加以刺激,模拟人体内高血糖环境,观察高糖诱导下GEnCs中NOD2及EndMT相关指标的表达水平;用NOD2激活剂MDP激活NOD2及用shRNA沉默NOD2表达以明确NOD2对高糖诱导的EndMT的影响;用U0126抑制MEK1/2表达观察EndMT相关信号通路分子的变化,验证MEK/ERK信号通路是否介导GEnCs EndMT。总体而言,我们研究NOD2是否通过MEK/ERK信号通路介导高糖诱导的GEnCs EndMT。方法1探究高糖诱导下GEnCs中NOD2及End MT相关指标的表达变化1.1观察不同浓度葡萄糖刺激下GEnCs中NOD2的表达水平。体外培养小鼠GEnCs并分成四组:正常对照组（葡萄糖5.6mmol/L）、20mmol/L葡萄糖组、40mmol/L葡萄糖组、渗透压对照组（5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇）,不同培养基作用24h后进行检测。Western Blot检测NOD2的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NOD2的mRNA表达水平,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测NOD2蛋白在GEn Cs中的定位及分布。1.2观察高糖不同刺激时间下GEnCs中EndMT相关指标（内皮细胞标志物CD31、间充质细胞标志物α-SMA）的表达水平。对小鼠GEnCs加以不同时间的高糖（葡萄糖40mmol/L）刺激,分别为12h、24h。Western Blot检测高糖刺激下CD31和α-SMA的蛋白表达水平。2探究NOD2在高糖诱导的GEnCs EndMT中的作用2.1观察MDP刺激下CD31、α-SMA的表达水平。对小鼠GEnCs加以不同时间的MDP（浓度为2ug/mL）刺激,分别为12h、24h。Western Blot检测MDP刺激下CD31和α-SMA的蛋白表达水平。2.2验证NOD2特异性shRNA对GEnCs的转染效率。将shRNA转染至GEnCs,体外培养小鼠GEnCs并分成三组:正常对照组、乱序对照（scramble）组、shRNA干扰组。Western Blot检测NOD2的蛋白表达水平。2.3观察shRNA沉默NOD2表达后GEnCs中CD31、α-SMA的蛋白表达水平。将shRNA转染至GEnCs,共分为四组:正常对照组、高糖组、高糖+scramble组、高糖+shRNA干扰组。Western Blot检测CD31和α-SMA的蛋白表达水平。3探究NOD2是否通过MEK/ERK信号传导途径介导高糖诱导下GEnCs EndMT3.1观察高糖刺激下GEnCs中MEK/ERK信号通路活性,Western Blot检测高糖诱导下MEK1/2、磷酸化MEK1/2（p-MEK1/2）的蛋白表达水平。相对应,对GEnCs加入MEK1/2抑制剂U0126刺激1h,后加入高糖培养24h,分组为:正常对照组、高糖组、高糖+抑制剂U0126组。Western Blot检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的蛋白表达水平。3.2观察高糖刺激下,

关键词：糖尿病肾病 NOD2 MEK/ERK信号通路内皮细胞间充质转分化