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斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因与gp41基因分析及带GFP标记的转移载体的构建

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斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因与gp41基因分析及带GFP标...

作者：胡兆丽苏州大学

学位级别：硕士

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)属NPV科A亚群。国内于1972年在广州地区首次从野外死亡的斜纹夜蛾虫体分离到这种病毒。其宿主斜纹夜蛾(Spodoptera litura,Spli)是鳞翅目夜蛾科的杂食性害虫,分布范围广,是我国粮棉、油等经济作物和蔬菜的重要害虫之一。应用SpltMNPV防治斜纹夜蛾是一种有效的生物防治方法,而通过基因工程手段构建新的高效杀虫病毒是改良生物病毒杀虫剂的重要途径。从分子水平深入地阐明SpltMNPV在体内的侵染、增殖规律、建立SpltMNPV载体表达系统是达到上述目的的理论基础和技术准备。因此,近年来对SpltMNPV的研究受到广泛关注,有关该病毒的序列测定、基因结构、功能和表达调控等分子生物学研究工作进展迅速,特别是对一些重要基因的结构分析,有助于筛选毒力较强的杀虫毒株,并为这一病毒杀虫剂的改良和发展以及组建昆虫杆状病毒表达载体奠定基础。本研究在Spli-SpltMNPV的模型中对ph及gp41基因进行了初步的研究,并尝试构建了新型的带有绿色荧光蛋白标记的转移载体,主要工作及成果如下: 1、克隆了SpltMNPV日本株A、B、C三种基因型的的多角体蛋白基因(polyhedrin,ph),该基因大小为747bp,根据其推导的氨基酸序列为249aa(GenBank登录号,A型:AY552474,B型:AY549963,C型:AY549964)。 2、克隆并表达了SpltMNPV日本C3株gp41基因,该基因编码区含993bp核苷酸,编码分子量为36.9kD的多肽(GenBank登陆号:AY605063)。分析了该基因的核苷酸和氨基酸序列特征,进行了GP41蛋白的二级结构预测以及gp41和ph的分子系统发育分析。将gp41基因克隆至原核表达载体pET28a(+),经IVIG诱导,SDS-PAGE显示该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达。 3、进行了构建以GFP为标记基因的斜纹夜蛾核型多角体病毒载体系统的尝试。使用SpltMNPV ph启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)基因为标记基因,构建新型转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SpltMNPV DNA共转染Spli细胞,通过同源

关键词：斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因 gp41 序列分析系统发育原核表达转移载体绿色荧光蛋白

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中职语文教育反思

新课程研究(中旬刊) 2013年第9期 136-136页

作者：胡兆丽广东省深圳市第二职业技术学校

语文课程是其他学科的基础,中职语文教育不仅要培养学生听说读写的能力,更要培养学生科学的价值观、人生观,帮助他们树立信心、确立人生目标,教他们为人处世。

关键词：中职语文人生观价值观

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

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昆虫学报 2004年第5期47卷 543-550页

作者：朱江沈颂东王文兵朱玉芳池田素子胡兆丽盛晔苏州大学生命科学学院江苏苏州215006 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013 日本名古屋大学大学院生命农学研究科

利用斜纹夜蛾Spodopteralitura培养细胞 ,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的 3株斜纹夜蛾核型多角体病毒 (SpltMNPV) (K 3、G1 2和G10 3)进行了生物学活性和分子生物学的初步研究 ,... 详细信息

利用斜纹夜蛾Spodopteralitura培养细胞 ,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的 3株斜纹夜蛾核型多角体病毒 (SpltMNPV) (K 3、G1 2和G10 3)进行了生物学活性和分子生物学的初步研究 ,克隆了多角体蛋白基因 ,并进行了序列分析和比较。结果表明 :(1)SpltMNPV日本分离株K 3、G1 2和G10 3分别具有不同的特征性酶切图谱 ,分别属于 3种基因型 (A型、B型和C型 ) ;(2 ) 3个分离株的芽生型病毒 (buddedvirus)产生能力和多角体产生能力有差异 ,免疫印迹分析表明 ,多角体蛋白的分子量也不同 ;(3)日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由 74 7个核苷酸编码序列 (编码 2 4 9个氨基酸 )组成 ,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为 98 9% ,与其他 6种核型多角体病毒有较高的同源性 (6 1 7%～ 74 2 % ) ,但其 5′端侧翼序列 (nt_1～_10 0 )与AcMNPV和BmNPV相比差异显著 ,在对该基因表达调控起决定性作用的 8个高度保守核苷酸序列中 (nt_4 4～_5 1)有 2处发生自然突变。

关键词：斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因序列分析增殖

杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

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生物工程学报 2005年第4期21卷 530-533页

作者：胡兆丽王文兵朱江李新平沈颂东苏州大学生命科学学院苏州215006 江苏大学生命科学研究院镇江212013

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBankSpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列(含启动子)和3′端侧翼序列(含终止子),将这... 详细信息

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBankSpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列(含启动子)和3′端侧翼序列(含终止子),将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt_gfp。将pSplt_gfp与野生型SpltMNPV基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV_gfp。SpltMNPV_gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。

关键词：杆状病毒转移载体绿色荧光蛋白斜纹夜蛾真核表达

SpltMNPV日本分离株gp41的克隆表达及gp41和ph的进化分析

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中国病毒学 2006年第1期21卷 57-63页

作者：胡兆丽朱江盛晔王文兵李新平沈颂东苏州大学生命科学学院江苏苏州215123 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013

从斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)日本分离株(C3)基因组中克隆了gp41基因。该基因编码区含993bp核苷酸,编码分子量为36.9kDa的多肽。将该基因克隆至原核表达载体pET28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达。应用CLUSTAL程序分析表明,SpltMNPV日本株(C3)gp41的核苷酸序列和氨基酸序列与SpltMNPV中国G2株相似性最高,均达99.9%。用MEGA分别构建了基于gp41和ph的聚类分析图和分子进化树,发现它们具有相似的拓扑结构。将这两个基因序列结合在一起构建进化树,该树的结构与基于gp41的进化树相似。突变率分析显示gp41的突变率高于ph,这意味着在杆状病毒进化过程中,gp41和ph面临不同的选择压力。

关键词：斜纹夜蛾核型多角体病毒 gp41 系统发育基因表达

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pegfp/glur6重组表达载体的构建

科技信息 2010年第2期 118-119页

作者：胡兆丽底洁卉张光毅徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心江苏省脑病生物信息重点实验室

目的:构建pegfp/glur6重组表达载体。方法:用基因重组技术构建pegfp/glur6重组表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜检测。结果:经酶切和PCR鉴定重组质粒pegfp/glur6重组表达载体构建成功。转染HEK293细... 详细信息

目的:构建pegfp/glur6重组表达载体。方法:用基因重组技术构建pegfp/glur6重组表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜检测。结果:经酶切和PCR鉴定重组质粒pegfp/glur6重组表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜显示融合蛋白在细胞中表达。结论:基因重组技术成功构建pegfp/glur6重组体。

关键词： GluR6 EGFP 基因重组转染

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脂肪干细胞复合明胶海绵修复兔桡骨缺损

中国组织工程研究 2013年第34期17卷 6083-6088页

作者：刘刚汪明星闫长明王云清魏学杰胡兆丽徐州医学院第二附属医院江苏省徐州市221000 徐州医学院生物化学与分子生物学实验室江苏省徐州市221004

背景:脂肪干细胞是近年来新发现的一种成体干细胞,有很强的多向分化能力,但其在体内成骨分化的能力研究较少。目的:考察脂肪组织来源间充质干细胞复合明胶海绵修复骨缺损的效果。方法:从兔腹股沟脂肪垫分离和培养脂肪干细胞,用含骨形态... 详细信息

背景:脂肪干细胞是近年来新发现的一种成体干细胞,有很强的多向分化能力,但其在体内成骨分化的能力研究较少。目的:考察脂肪组织来源间充质干细胞复合明胶海绵修复骨缺损的效果。方法:从兔腹股沟脂肪垫分离和培养脂肪干细胞,用含骨形态发生蛋白2的成骨诱导培养液进行培养,然后注入明胶海绵继续培养。制作兔桡骨缺损模型,将脂肪干细胞-明胶海绵复合体植入实验侧兔桡骨缺损区,对照侧植入明胶海绵。于骨缺损修复后第6,12周处死动物,取标本进行X射线、CT扫描、苏木精-伊红染色作放射学和组织学评价。结果与结论:兔桡骨缺损修复后6,12周,植入明胶海绵-脂肪干细胞复合体的实验侧的Lane-SandhuX射线评分和Lane-Sandhu组织学评分均比对照侧显著升高,说明实验侧骨缺损修复更好。结果表明脂肪干细胞-明胶海绵复合体对兔长骨骨缺损修复有促进作用,具有较明显的体内诱导成骨作用。

关键词：生物材料组织工程骨材料脂肪干细胞桡骨缺损骨形态发生蛋白细胞培养组织学放射学