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人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应

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细胞与分子免疫学杂志 2004年第6期20卷 760-763页

作者：李昂杨谨来宝长耿宜萍王艳王一理司履生西安交通大学生命科学与技术学院肿瘤研究所陕西西安710061

目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂... 详细信息

目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂 (pLXHDmB7 2或LTB)。用免疫原免疫 3次 ,末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测。末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应 (DTH)试验。断足进行小鼠足垫HE染色。取小鼠脾脏制成单细胞悬液 ,进行脾细胞增殖试验 ,并进行CD4 + /CD8+ T细胞中IFN γ+ 或IL 4 + 细胞的FACS分析。结果 :与对照组相比 ,各实验组均获得明显的免疫效果。实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前 ;肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高。实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结 ,镜下观察可见大量单核细胞侵润。肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数 (SI)和CD8+ IFN γ+ 细胞数均高于鼻内滴注组 ;而鼻内滴注组CD4 + IL 4 + 细胞数高于单纯质粒肌肉接种组 ;加入pLX HDmB7 2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组。结论 :证实了重组pVAX1 HPV18L1/E6、E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应。同时 ,证实B7 2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应?

关键词：人乳头瘤病毒18型 DNA疫苗免疫效应体内

人重组TNF-α突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第4期19卷 409-412页

作者：李瑶琛孔令洪王一理尚宁宽耿宜萍司履生西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所陕西西安710061

目的 :在利用原核表达系统表达重组人突变体 4 71TNF α蛋白的基础上 ,对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法 :利用最佳发酵和表达条件 ,诱导基因重组的人突变体4 71TNF α工程菌表达目的蛋白。收集菌体 ,经超声破碎 ,分离人突变... 详细信息

目的 :在利用原核表达系统表达重组人突变体 4 71TNF α蛋白的基础上 ,对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法 :利用最佳发酵和表达条件 ,诱导基因重组的人突变体4 71TNF α工程菌表达目的蛋白。收集菌体 ,经超声破碎 ,分离人突变体 4 71TNF α的包涵体 ,并观察变性剂及蛋白浓度对蛋白折叠的影响。采用MTT比色法检测并比较人野生型及突变体 4 71TNF α的生物学活性。结果 :在适当的变性与复性条件下 ,已成功地将突变体 4 71TNF α折叠并聚合形成具有生物学活性的三聚体。突变体 4 71TNF α对L92 9的细胞毒活性高于野生型TNF α的 15倍。结论 :原核表达系统中表达的人突变体 4 71TNF α经复性处理后具有显著的生物学活性。

关键词：人突变体471 TNF—α 蛋白纯化 MTT比色法生物学活性

非小细胞肺癌患者胸水淋巴细胞中5种细胞因子的检测

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中华微生物学和免疫学杂志 2001年第1期21卷 111-112页

作者：李睿王一理司履生耿宜萍来宝长杨岚李蓉西安医科大学免疫病理教研室西安医科大学第一临床医学院呼吸内科西安医科大学第一临床医学院肿瘤内科

细胞介导的免疫应答是抗瘤免疫的主要效应途径。而免疫的反应类型则取决于免疫系统受抗原刺激后产生的不同细胞因子的调节作用，IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4、TGF-β1是影响免疫应答类型的关键。

关键词：非小细胞肺癌细胞因子检测胸水淋巴细胞

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第6期18卷 558-561页

作者：李昂郑瑾来宝长耿宜萍王艳王一理司履生西安交通大学生命科学与技术学院肿瘤研究所陕西西安710061

目的　构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法　克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基... 详细信息

目的　构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法　克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果　ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论　所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。

关键词： L1-E6 L1-E7 人乳头瘤病毒18型表达载体定点突变

重组人突变型471TNF-α及野生型TNF-α的表达及活性初步鉴定

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西安交通大学学报（医学版） 2003年第1期24卷 14-16,29页

作者：李瑶琛孔令洪王一理尚宁宽耿宜萍司履生西安交通大学生命科学与技术学院免疫病理研究室西安710061

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,... 详细信息

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,转入大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达野生型及突变型 471TNF α蛋白。初步纯化蛋白后 ,采用MTT法评估两者对L92 9细胞的杀伤作用。结果　①获得了测序正确的野生型TNF α及突变型 471TNF α的cDNA克隆 ;②构建了正常人野生型TNF α及突变型 471TNF α重组表达质粒 ;③经温度诱导 ,TNF α及突变型 471TNF α蛋白均获得了表达 ;④初步的生物学活性研究表明 ,突变型 471TNF α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论　突变型 471TNF α的生物学活性优于野生型TNF α ,为进一步开展TNF

关键词： TNF-α 突变体蛋白表达

突变型人肿瘤坏死因子-α工程菌发酵培养的实验研究

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西安交通大学学报（医学版） 2003年第3期24卷 211-214页

作者：孔令洪李瑶琛王一理尚宁宽耿宜萍司履生西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所陕西西安710061

目的　优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法　通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌... 详细信息

目的　优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法　通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果　突变型 4 71rhTNF α工程菌在 pH值 7.5的SOC培养基中 ,30℃培养、4 2℃诱导 5h时 ,其表达量最大。而且 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,目的蛋白的表达不受影响。结论　优化了基因重组人突变型 4 71rhTNF α工程菌的发酵和表达的最适条件 ,为进一步开发人突变型 4 71rhTNF

关键词：突变型人肿瘤坏死因子-α 工程菌发酵培养实验重组质粒遗传稳定性肿瘤细胞

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人IL-18cDNA克隆及原核表达

西安医科大学学报 2001年第4期22卷 301-303页

作者：安小惠王一理耿宜萍来宝长司履生西安交通大学免疫病理研究室西安710061

目的　从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法　从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表... 详细信息

目的　从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法　从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表达产物通过SDS PAGE、WesternBlot证实。结果　所克隆的人IL 1 8cDNA编码序列经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致 ,细菌表达产物经SDS PAGE证实其大小约为 1 8.3KDa,WesternBlot进一步证实了所表达产物的正确性。结论　本研究结果为进一步探讨IL 1 8的生物学活性和特性奠定了基础 ,同时亦为利用人IL 1 8进行免疫基因治疗的研究打下了良好的基础。

关键词：人白细胞介素18 基因克隆原核表达 IL-18cDNA 细胞因子克隆人

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抗B7.1分子不同亚区单克隆抗体的制备

中华病理学杂志 2001年第4期30卷 303-304页

作者：陈梅珍司履生王一理耿宜萍刘天菊西安交通大学生命科学院免疫病理学研究室

B7分子是T细胞活化过程中的一个重要共刺激分子.B7.1为B7家族成员之一,主要诱导T细胞活化,产生细胞免疫应答,在维持生理自稳、抗肿瘤免疫、移植物排斥反应中均起重要作用[1-3].深入研究B7.1分子结构,寻找其实现协同活化T细胞的有效表位... 详细信息

B7分子是T细胞活化过程中的一个重要共刺激分子.B7.1为B7家族成员之一,主要诱导T细胞活化,产生细胞免疫应答,在维持生理自稳、抗肿瘤免疫、移植物排斥反应中均起重要作用[1-3].深入研究B7.1分子结构,寻找其实现协同活化T细胞的有效表位,探索各有效表位调整疾病时的免疫功能,使之向有利于宿主方向发展是十分必要的.抗B7.1抗体,尤其是抗B7.1分子不同亚区的抗体是进行这种研究必不可少的工具.

关键词：抗B7.1分子不同亚区单克隆抗体制备

人大肠癌细胞蛋白质组中免疫球蛋白重链可变区和B7-1的表达

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中华肿瘤杂志 2005年第11期27卷 648-652页

作者：张盈涛耿宜萍来宝长司履生王一理西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所生物医学信息工程教育部重点实验室

目的分析人大肠癌LS174T及SW 480细胞株的蛋白质表达谱。方法通过固相pH梯度双向凝胶电泳分离人大肠癌LS174T及SW 480细胞总蛋白质,经基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD I-TOF-MS)获得肽质量指纹图(PMFs),通过M ascot软件查询蛋... 详细信息

目的分析人大肠癌LS174T及SW 480细胞株的蛋白质表达谱。方法通过固相pH梯度双向凝胶电泳分离人大肠癌LS174T及SW 480细胞总蛋白质,经基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD I-TOF-MS)获得肽质量指纹图(PMFs),通过M ascot软件查询蛋白质数据库进行蛋白质的初步鉴定。结果获得了分辨率较高的人大肠癌LS174T及SW 480细胞的双向电泳图谱,初步鉴定了一批蛋白质,包括免疫球蛋白重链可变区(IgVH)和共刺激分子B7-1,并通过电喷雾离子阱串联质谱(ESI-MS/MS)分析和免疫细胞化学染色得到进一步证实。结论在人大肠癌LS174T和SW 480细胞中存在IgVH和B7-1的表达,这一发现有助于进一步阐明肿瘤的免疫逃逸机制。

关键词：大肠癌蛋白质组免疫球蛋白重链可变区 B7-1