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DNMT1与T淋巴细胞因子在急性髓系白血病中的表达水平及相关性分析

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检验医学与临床 2024年第11期21卷 1528-1532页

作者：许晨晨李轶勋李姿璇程沈菊史明霞武坤昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院医学检验科/云南省检验医学重点实验室/云南省医学检验临床医学研究中心云南昆明650032

目的分析DNA甲基转移酶1(DNMT1)与T淋巴细胞因子在急性髓系白血病(AML)中的表达水平及相关性。方法选取昆明医科大学第一附属医院2020年1月至2022年12月收治的初诊AML患者作为AML组(38例),另选取同期在昆明医科大学第一附属医院进行骨... 详细信息

目的分析DNA甲基转移酶1(DNMT1)与T淋巴细胞因子在急性髓系白血病(AML)中的表达水平及相关性。方法选取昆明医科大学第一附属医院2020年1月至2022年12月收治的初诊AML患者作为AML组(38例),另选取同期在昆明医科大学第一附属医院进行骨髓穿刺的缺铁性贫血患者作为对照组(21例)。检测并比较两组骨髓DNMT1的信使RNA(mRNA)表达水平及T淋巴细胞因子[白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)]水平,以及比较不同临床特征AML患者DNMT1表达水平。采用Pearson相关分析AML患者DNMT1表达水平与T淋巴细胞因子水平的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析DNMT1、T淋巴细胞因子单独及联合检测对AML的诊断效能。结果AML组DNMT1 mRNA表达水平高于对照组(P<0.001)。白细胞计数(WBC)≥5.0×10^(10)/L、骨髓幼稚细胞比例≥60%、外周血幼稚细胞比例≥60%、乳酸脱氢酶(LDH)≥300 U/L、骨髓外浸润、染色体核型预后不良患者DNMT1表达水平分别高于WBC<5.0×10^(10)/L、骨髓幼稚细胞比例<60%、外周血幼稚细胞比例<60%、LDH<300 U/L、无骨髓外浸润、染色体核型预后良好患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。AML组血清IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ水平高于对照组,TGF-β水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,DNMT1表达水平与IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ水平呈正相关(r=0.574、0.619、0.527、0.483,P<0.05),与TGF-β水平呈负相关(r=-0.475,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,DNMT1联合IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ检测诊断AML的曲线下面积分别为0.918、0.711、0.756、0.726。结论AML患者的DNMT1表达水平升高、T淋巴细胞因子表达失衡,二者存在一定相关性,DNMT1与部分T淋巴细胞因子联合检测对AML具有诊断价值。

关键词： DNA甲基转移酶1 T淋巴细胞因子急性髓系白血病信使RNA 相关性

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Logistic回归模型鉴别缺铁性贫血和地中海贫血的研究

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中国生物工程杂志 2023年第12期43卷 111-118页

作者：李轶勋郭翀潘玉卿程沈菊武坤昆明医科大学第一附属医院医学检验科昆明650032 云南省检验医学重点实验室昆明650032 云南省医学检验临床医学研究中心昆明650032

目的:建立Logistic回归模型,用于鉴别缺铁性贫血和地中海贫血,并评价和验证模型的有效性。方法:收集2021~2022年昆明医科大学第一附属医院确诊缺铁性贫血和地中海贫血各121例患者资料,随机每组抽取100个病例样本数据为实验组,剩余21个... 详细信息

目的:建立Logistic回归模型,用于鉴别缺铁性贫血和地中海贫血,并评价和验证模型的有效性。方法:收集2021~2022年昆明医科大学第一附属医院确诊缺铁性贫血和地中海贫血各121例患者资料,随机每组抽取100个病例样本数据为实验组,剩余21个样本数据为验证组。经单因素分析,确定具有统计学差异的变量,并将其纳入多因素分析,可得性别、Hb、MCHC和RDW⁃SD 4个变量为独立影响因素,并用这4个变量建立Logistic回归模型,以受试者操作特征(ROC)曲线下面积、灵敏度、特异度三个指标评估模型鉴别诊断效果。结果:单因素变量分析显示,RBC、Hb、HCT、MCV、MCH和MCHC值,缺铁性贫血组均低于地中海贫血组,RDW⁃SD值缺铁性贫血组高于地中海贫血组,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。将性别、Hb、MCH、MCHC和RDW⁃SD带入二元Logistic回归分析,结果显示,RDW⁃SD值越高患缺铁性贫血的风险越高,Hb和MCHC下降越明显患缺铁性贫血的风险越高(P<0.05)。Logistic回归模型为:Logit(P)=-19.288-1.685X1+0.035X2+0.066X3-0.076X4。实验组的Logistic模型ROC曲线下面积为0.947,灵敏度为90%,特异度为91%;验证组的灵敏度和特异度分别为100%和72.4%。结论:基于Logistic回归的数学模型在缺铁性贫血和地中海贫血的鉴别诊断中有一定临床应用价值。

关键词：缺铁性贫血地中海贫血 Logistic回归模型鉴别诊断

大电导钙依赖性钾通道参与脓毒症炎症应答的机制研究

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中华危重病急救医学 2023年第5期35卷 469-475页

作者：武坤赵凌峰王雨平刘盼程沈菊杨潇王英祝艳翠昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院血管外科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院重症医学科云南昆明650032 云南红河哈尼族彝族自治州第三人民医院医学检验科云南个旧661000

目的探讨大电导钙依赖性钾通道(BKCa)参与脓毒症发病的机制。方法收集脓毒症患者(28例)、普通感染者(25例)和健康体检者(25例)血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BKCa水平;并分析脓毒症患者血清BKCa水平与急性生理学与慢性健康状况... 详细信息

目的探讨大电导钙依赖性钾通道(BKCa)参与脓毒症发病的机制。方法收集脓毒症患者(28例)、普通感染者(25例)和健康体检者(25例)血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BKCa水平;并分析脓毒症患者血清BKCa水平与急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)的相关性。培养RAW 264.7细胞,用脂多糖(LPS)刺激,部分实验以尼日尼亚菌素(Nigericin)作为第二刺激信号构建脓毒症细胞模型;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)测定不同浓度LPS(0、50、100、1000μg/L)刺激后细胞BKCa的mRNA和蛋白表达。RAW 264.7细胞转染BKCa的小干扰RNA(siRNA-BKCa),用Western blotting测定细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1前体(pro-caspase-1)、白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β),细胞培养液中caspase-1 p20、IL-1βp17,以及NOD样受体蛋白3(NLRP3)、核转录因子-κB(NF-κB)水平。碘化丙啶(PI)染色后荧光显微镜下观察凋亡情况,测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率,Western blotting测定细胞凋亡蛋白Gasdermin D(GSDMD)表达以评估沉默BKCa对细胞焦亡的影响。结果脓毒症患者血清BKCa明显高于普通感染者和健康体检者(ng/L:165.2±25.9比102.5±25.9、98.8±20.0,均P<0.05),且脓毒症患者血清BKCa水平与APACHEⅡ评分呈显著正相关(r=0.453,P=0.013)。用LPS构建脓毒症细胞模型,显示LPS呈浓度依赖地促进BKCα的mRNA和蛋白表达,1000μg/L刺激后细胞BKCa的mRNA和蛋白表达水平均较空白组(0μg/L)明显增加〔BKCa mRNA(2^(-ΔΔCt)):3.00±0.36比1.00±0.16,BKCa/β-actin:1.30±0.16比0.37±0.09,均P<0.05〕。与对照组比较,模型组细胞caspase-1 p20/pro-caspase-1比值、IL-1βp17/pro-IL-1β比值均明显升高(caspase-1 p20/pro-caspase-1比值:0.83±0.12比0.27±0.05,IL-1βp17/pro-IL-1β比值:0.77±0.12比0.23±0.12,均P<0.05);但转染siRNA-BKCa后二者均较模型组明显下降(caspase-1 p20/pro-caspase-1比值:0.23±0.12比0.83±0.12,IL-1βp17/pro-IL-1β比值:0.13±0.05比0.77±0.12,均P<0.05)。与对照组比较,镜下观察模型组凋亡细胞明显增多,LDH释放率、GSDMD表达明显增加〔LDH释放率:(30.60±8.40)%比(15.20±7.10)%,GSDMD-N/GSDMD-FL:2.10±0.16比1.00±0.16,均P<0.05〕;但转染siRNA-BKCa后上述指标均较模型组明显下降〔LDH释放率:(15.60±7.30)%比(30.60±8.40)%,GSDMD-N/GSDMD-FL:1.13±0.17比2.10±0.16,均P<0.05〕。脓毒症细胞NLRP3的mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显增加〔NLRP3 mRNA(2^(-ΔΔCt)):2.06±0.17比1.00±0.24,NLRP3/GAPDH:0.46±0.05比0.15±0.04,均P<0.05〕;但转染siRNA-BKCa后NLRP3表达较模型组明显下降〔NLRP3 mRNA(2^(-ΔΔCt)):1.57±0.09比2.06±0.17,NLRP3/GAPDH:0.19±0.02比0.46±0.05,均P<0.05〕。与对照组比较,脓毒症细胞NF-κB p65核转移明显增加(NF-κB p65/Histone:0.73±0.12比0.23±0.09,P<0.05);而转染siRNA-BKCa后细胞核中NF-κB p65表达明显下降(NF-κB p65/Histone:0.20±0.03比0.73±0.12,P<0.05)。结论BKCa参与脓毒症发病,其可能机制是激活NF-κB/NLRP3/caspase-1信号通路诱导炎症因子生成和细胞焦亡。

关键词：大电导钙依赖性钾通道脓毒症核转录因子-κB NOD样受体蛋白3 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1

DNMT3a在氢醌致造血干细胞毒性中的作用研究

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中国实验血液学杂志 2022年第2期30卷 607-612页

作者：武坤聂波杨金荣贺振新程沈菊李艳红晋臻史明霞昆明医科大学第一附属医院医学检验科(云南省检验医学重点实验室临床检验诊断省创新团队)云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院血液科(云南省血液病研究中心) 云南昆明650032

目的:探讨DNA甲基转移酶3A(DNMT3a)在氢醌(HQ)致造血干细胞毒性中的调控作用及其机制。方法:人造血干细胞HSPC-1随机分为4组,A组:正常HSPC-1;B组:HQ干预HSPC-1;C组:B组+转染pcDNA3空载体;D组:B组+pcDNA3-DNMT3a。采用RT-qPCR法检测DNMT3a、PARP-1 mRNA表达情况;免疫印迹法检测DNMT3a、PARP-1蛋白表达水平。显微镜下观察细胞形态;MTT、流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡率。结果:与A组相比,B组细胞DNMT3a mRNA及蛋白表达降低、PARP-1 mRNA及蛋白水平升高(P0.05);D组HSPC-1转染DNMT3a后,DNMT3a mRNA及蛋白水平较B组升高,PARP-1 mRNA及蛋白水平降低(P0.05);转染24、48、72 h后D组细胞活力均明显高于B组(P0.05),D组细胞凋亡率明显低于B组(P程,氢醌细胞损伤作用的发挥可能与DNMT3a表达受抑后对PARP-1活性的调节有关。

关键词：造血干细胞 DNMT3a 氢醌 PARP-1 形态凋亡

淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识

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国际检验医学杂志 2023年

作者：陈双程沈菊蒋亭亭李轶勋刘耀彭余武坤杨再林中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会昆明医科大学第一附属医院重庆大学附属肿瘤医院

血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，其发病机制复杂，环境因素、遗传因素、免疫因素等都被认为与疾病的发生、进展密切相关。淋巴细胞亚群中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤淋巴细胞及淋巴细胞功能亚群调节性T细胞是细胞免疫检测... 详细信息

血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，其发病机制复杂，环境因素、遗传因素、免疫因素等都被认为与疾病的发生、进展密切相关。淋巴细胞亚群中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤淋巴细胞及淋巴细胞功能亚群调节性T细胞是细胞免疫检测的常用指标，广泛用于血液肿瘤患者的免疫状态评估、疾病复发或转移风险预测及治疗指导等。为了更加深刻认识淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的作用，加强其检测过程的质量管理，促进其规范地应用于临床，由中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会牵头组织国内血液肿瘤和临床检验领域多位专家，制定了该专家共识。该共识介绍了淋巴细胞亚群的检测方法，归纳总结了其对血液肿瘤筛查、复发转移预警及预后评估、合并感染风险预警、造血干细胞移植后免疫重建监测与移植物抗宿主病预防、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗后监测、用药指导与疗效监测等方面的应用，并对血液肿瘤患者的监测方案与随访时机选择做出了推荐。

关键词：淋巴细胞亚群 T淋巴细胞 B淋巴细胞自然杀伤细胞调节性T细胞流式细胞术免疫血液肿瘤

WNK1通过磷酸化激活MAPK7对人慢性髓系白血病K562细胞的影响及相关机制

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中国实验血液学杂志 2020年第2期28卷 365-370页

作者：武坤聂波周强杨金荣程沈菊李艳红曾云昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室云南省实验诊断研究所昆明医科大学第一附属医院血液科云南省血液病研究中心云南昆明650032

目的:探讨WNK1通过调控MAPK7对人慢性髓系白血病K562细胞的影响及相关机制。方法:通过体外培养不同肿瘤细胞,采用RT-qPCR和Western blot分析WNK1、MAPK7在不同血液肿瘤细胞系中的表达。通过慢病毒转染siRNA-WNK1至K562细胞,采用流式细... 详细信息

目的:探讨WNK1通过调控MAPK7对人慢性髓系白血病K562细胞的影响及相关机制。方法:通过体外培养不同肿瘤细胞,采用RT-qPCR和Western blot分析WNK1、MAPK7在不同血液肿瘤细胞系中的表达。通过慢病毒转染siRNA-WNK1至K562细胞,采用流式细胞术分析细胞凋亡情况,以及K562细胞中总MAPK7、磷酸化MAPK7表达的变化,通过CCK-8方法检测细胞增殖,并进行统计学分析。结果:WNK1的mRNA及蛋白在HL-60、THP-1、U266和K562细胞中均高表达,但是在K562细胞中表达水平最高(P0.05),但是在K562细胞中磷酸化MAPK7的表达最高(P0.05)。结论:WNK1在K562细胞中高表达,能够促进K562细胞增殖、抑制凋亡等恶性细胞生物学行为,其机制可能是促进了下游MAPK7的磷酸化。

关键词： WNK1 K562细胞细胞增殖细胞凋亡

沉默DNMT1减弱WIF-1基因启动子甲基化对慢性髓系白血病K562细胞生物学行为的影响

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中国实验血液学杂志 2021年第6期29卷 1768-1774页

作者：武坤晋臻李轶勋李昕程沈菊李艳红郭翀昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院云南省检验医学重点实验室云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院医学临床检验诊断省创新团队云南昆明650032

目的:探讨沉默DNA甲基转移酶(DNMT1)对人慢性髓系白血病细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子甲基化的影响。方法:构建DNMT1 siRNAi质粒,将DNMT1 siRNAi转染至慢性髓系白血病K562细胞中,采用RT-PCR和Western blot法检测DNMT1... 详细信息

目的:探讨沉默DNA甲基转移酶(DNMT1)对人慢性髓系白血病细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子甲基化的影响。方法:构建DNMT1 siRNAi质粒,将DNMT1 siRNAi转染至慢性髓系白血病K562细胞中,采用RT-PCR和Western blot法检测DNMT1基因和相关蛋白的表达,并利用甲基化PCR检测WIF-1基因启动子甲基化水平,台盼蓝拒染法和MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞的凋亡率,集落形成实验检测细胞的集落形成能力,Western blot法检测沉默DNMT1基因后Wnt/β-catenin及其下游信号通路蛋白的表达情况。结果:实验组DNMT1 mRNA和相关蛋白表达水平显著低于对照组和阴性对照组(P<0.05);成功转染72 h后,对照组和阴性对照组WIF-1基因处于完全甲基化状态,而实验组WIF-1基因启动子区域甲基化水平显著降低。MSP检测结果显示,实验组未甲基化的WIF-1引物扩增出的PCR产物含量显著增加,而甲基化的WIF-1引物扩增出的PCR产物含量显著降低。转染成功48 h后,实验组的OD值、活细胞数及集落形成数均显著低于阴性对照组和对照组(P<0.05)。实验组的细胞凋亡率显著高于阴性对照组和对照组(P<0.05)。实验组K562细胞中β-actin、myc、cyclin D1和TCF-1蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和对照组(P<0.05)。结论:沉默DNMT1基因能够抑制K562细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关。

关键词： DNA甲基转移酶1 人慢性髓系白血病高甲基化 Wnt抑制因子-1

基于供者因素分析异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病的影响

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四川医学 2023年第5期44卷 509-513页

作者：武坤刘丹马晓波贺振新程沈菊罗珊曾云聂波昆明医科大学第一附属医院医学检验科血液科云南昆明650032

目的探讨供者因素对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后发生急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响。方法2015年1月至2021年12月我院行异基因造血干细胞移植的患者62例为研究对象,发生aGVHD的患者为发病组,其余纳入未发病组。回顾性分析患者... 详细信息

目的探讨供者因素对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后发生急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响。方法2015年1月至2021年12月我院行异基因造血干细胞移植的患者62例为研究对象,发生aGVHD的患者为发病组,其余纳入未发病组。回顾性分析患者、异基因造血干细胞移植者临床资料,分析供者因素对aGVHD的影响,并进行统计学分析。结果共28例患者发生aGVHD,发生率为45.2%,其中Ⅰ~Ⅱ度为21例,Ⅲ~Ⅳ度为7例。发病组供者平均年龄(35.7±6.2)岁,明显高于对照组(27.1±3.8)岁(P0.05);Logistic回归分析显示,供者年龄、供者、受体性别不同(男供女)、ABO血型不合、HLA不全相合是allo-HSCT后aGVHD发病的独立危险因素(P<0.05);性别不同、ABO血型不合、HLA配型不全合均会使aGVHD发病提前(P<0.05)。结论供者因素对allo-HSCT后aGVHD发病具有一定影响,其中年龄、性别、血型、HLA配型需是其独立危险因素,移植前值得重视。

关键词：供者异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病因素

qSOFA评分联合中性粒细胞CD64指数对恶性血液病患者血流感染的早期诊断价值

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国际检验医学杂志 2022年第4期43卷 436-440页

作者：武坤祝艳翠袁峰杨金荣程沈菊李艳红聂波昆明医科大学第一附属医院医学检验科/云南省检验医学重点实验室/临床检验诊断省创新团队云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院重症医学科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院医学影像科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心云南昆明650032

目的探讨快速序贯器官衰竭评估(qSOFA)评分联合中性粒细胞CD64指数(简称CD64指数)对恶性血液病患者血流感染的早期诊断价值。方法选择该院2019年6月至2020年6月收治的45例恶性血液病血流感染患者为研究对象(感染组),另选择同期恶性血液... 详细信息

目的探讨快速序贯器官衰竭评估(qSOFA)评分联合中性粒细胞CD64指数(简称CD64指数)对恶性血液病患者血流感染的早期诊断价值。方法选择该院2019年6月至2020年6月收治的45例恶性血液病血流感染患者为研究对象(感染组),另选择同期恶性血液病无感染患者45例(非感染组)作为对照。测定CD64指数及肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、降钙素原(PCT)水平,评估患者的qSOFA评分。分析qSOFA评分、CD64指数与TNF-α、IL-6的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标的诊断价值;采用Logistic回归分析血流感染发生的危险因素。结果感染组患者qSOFA评分、CD64指数、TNF-α、IL-6水平明显高于非感染组(P<0.05),感染组中死亡患者qSOFA评分、CD64指数、TNF-α、IL-6水平明显高于非死亡患者(P<0.05);血流感染患者qSOFA评分、CD64指数与TNF-α、IL-6呈正相关(P<0.05)。qSOFA评分诊断恶性血液病患者血流感染的曲线下面积为0.637(95%CI:0.582~0.755),CD64指数诊断恶性血液病患者血流感染的曲线下面积为0.705(95%CI:0.695~0.813);qSOFA评分联合CD64指数诊断恶性血液病患者血流感染的曲线下面积为0.878(95%CI:0.831~0.926)。qSOFA评分、CD64指数、TNF-α、IL-6是恶性血液病患者发生血流感染的危险因素(P<0.05)。结论qSOFA评分、CD64指数联合应用对恶性血液病患者血流感染的早期诊断具有一定价值。

关键词：快速序贯器官衰竭评估评分中性粒细胞CD64指数恶性血液病血流感染