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鲮源嗜水气单胞菌的鉴定、生物学特性及防控药物筛选

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广东农业科学 2024年

作者：刘丽娟任燕石存斌周爱国王庆张德锋中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室华南农业大学海洋学院

【目的】近年来，广东省多个地区的规模化鲮鱼养殖场鲮鱼出现体表出血、腹水和肠炎等症状，明确鲮（Cirrhinus molitorella）暴发性死亡的病原菌种类及其生物学特性，筛选能有效抑制病原菌的药物或微生态制剂，为鲮鱼气单胞菌败血症的... 详细信息

【目的】近年来，广东省多个地区的规模化鲮鱼养殖场鲮鱼出现体表出血、腹水和肠炎等症状，明确鲮（Cirrhinus molitorella）暴发性死亡的病原菌种类及其生物学特性，筛选能有效抑制病原菌的药物或微生态制剂，为鲮鱼气单胞菌败血症的科学防治提供指导。【方法】从患病鲮鱼的肝脏和肾脏等部位分离纯化细菌，通过16S rRNA、gyrB基因测序以及生理生化特征分析进行细菌鉴定，通过毒力基因PCR检测和人工感染试验分析分离菌株的致病性，利用纸片扩散法评估分离菌株的耐药性，通过拮抗抑菌试验分析3株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对分离菌株的抑菌效果，通过微量二倍稀释法评估12种中草药对分离菌株的抑菌和杀菌效果。【结果】从4个养殖场患病鲮鱼体内分离纯化得到10株分离株，根据分离菌株的形态特征、生物学特性，结合16S rRNA序列测定、gyrB基因分析结果，确定其均为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。毒力基因PCR检测结果显示分离菌株均携带act、aer、alt、ahyB、eprCAI、fla、gcaT、ast、lip和exu毒力基因，属于广泛流行的毒力基因 Ⅰ 型菌株，人工感染试验结果表明这些菌株均具有较强致病能力。抗生素敏感性试验结果显示分离菌株对氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类和氯霉素类等抗生素药物敏感，对中草药姜黄素敏感度较高。贝莱斯芽孢杆菌WLYS23、CYS06和LF01菌株对分离菌株均具有较强的抑菌活性。【结论】引起鲮鱼死亡的病原菌为嗜水气单胞菌，含有10种毒力基因，具有高致病性，推荐选用多西环素、恩诺沙星或氟苯尼考进行科学防治。此外，3株贝莱斯芽孢杆菌对分离菌株具有较好的抑菌效果，可作为鲮鱼气单胞菌败血症潜在的生防菌，具有广泛的应用前景；姜黄素对分离菌株的抑菌效果较好，推荐作为防控嗜水气单胞菌的绿色候选药物。

关键词：嗜水气单胞菌致病性拮抗抑菌效果药物敏感性绿色防控

贝莱斯芽孢杆菌LF01基因组序列分析及其代谢产物的生防作用

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水产学报 2022年第2期46卷 196-206页

作者：张德锋高艳侠可小丽王亚军任燕石存斌中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室

为充分挖掘贝莱斯芽孢杆菌LF01菌株拮抗物质合成相关基因簇，实验对其进行了全基因组测序与分析，同时评价了LF01菌株拮抗物质的生物安全性及其生防作用效果。基于三代Nanopore测序平台对LF01菌株进行全基因组测序分析，并利用在线平均... 详细信息

为充分挖掘贝莱斯芽孢杆菌LF01菌株拮抗物质合成相关基因簇，实验对其进行了全基因组测序与分析，同时评价了LF01菌株拮抗物质的生物安全性及其生防作用效果。基于三代Nanopore测序平台对LF01菌株进行全基因组测序分析，并利用在线平均核苷酸同源性(ANI)和DNA-DNA杂交(DDH)分析，以及基因组遗传进化确定该菌株的分类学地位；通过antiSMASH在线分析LF01基因组中的拮抗物质合成基因簇。同时，基于CAZyme数据库分析LF01菌株对糖类物质的水解能力。LF01菌株拮抗物质通过腹腔注射的方式，检测其对尼罗罗非鱼和斑马鱼的致病性；拮抗物质饲喂尼罗罗非鱼后评价其生防作用效果。结果显示，LF01菌株基因组全长为3 974 023 bp,GC含量为46.56%，包含3 843个编码基因。LF01菌株与贝莱斯芽孢杆菌的ANI和DDH分别≥97.66%和≥80.10%，同时基于SNP进化分析显示，该菌与贝莱斯芽孢杆菌聚为一支，表明LF01菌株在基因组分子水平上被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。LF01菌株包含了bacillaene、bacillibactin、杆菌霉素D(bacillomycin D)、溶杆菌素(bacilysin)、difficidin、泛革素(fengycin)、macrolactin H、plantazolicin和表面活性素(surfactin)等9个拮抗物质基因簇，约占基因组全长的8.83%。LF01菌株基因组中含有许多与纤维素、半纤维素、淀粉、几丁质、果胶、肽聚糖和葡聚糖降解有关的CAZy酶基因家族。LF01的拮抗物质对尼罗罗非鱼和斑马鱼具有较高的安全性，而且饲喂尼罗罗非鱼后能够显著提高其对无乳链球菌的抗病力。综上可知，LF01菌株含有大量拮抗物质合成基因簇，其拮抗物质具有较高的生物安全性，并且饲喂后能够显著提高尼罗罗非鱼的抗病力，表明LF01菌株拮抗物质在水产动物细菌性疾病的防控方面具有良好的开发应用前景。

关键词：贝莱斯芽孢杆菌基因组测序拮抗物质生防作用

微载体规模化培养草鱼鳔细胞以增殖Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的工艺研究

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海洋渔业 2022年第5期44卷 577-588页

作者：杨玉茹王英英王庆周文礼尹纪元石存斌天津农学院水产学院天津300384 中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔药创制重点实验室广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室广州510380

为优化草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳔细胞(CiSB)细胞悬浮培养工艺,以提高基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)含量,利用Cytodex 1微载体悬浮培养系统规模化培养CiSB和Ⅱ型GCRV,对CiSB细胞初始接种密度、搅拌转速和微... 详细信息

为优化草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳔细胞(CiSB)细胞悬浮培养工艺,以提高基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)含量,利用Cytodex 1微载体悬浮培养系统规模化培养CiSB和Ⅱ型GCRV,对CiSB细胞初始接种密度、搅拌转速和微载体浓度等工艺参数进行摸索和优化。结果显示,在CiSB细胞贴壁期,以转速30 r·min^(-1)、每静置30 min搅拌2 min的间歇搅拌方式培养最佳,4 h后细胞贴附率可达96%以上;在微载体密度2 g·L^(-1)、细胞初始接种密度2×10^(5)个·mL^(-1)、搅拌速度30 r·min^(-1)的条件下,初始培养血清浓度设定为10%,培养3 d后更换50%的培养基并使血清浓度达到5%,可获得最佳的细胞生长效能。CiSB经消化转移放大至1 L,微载体上细胞贴附均匀、生长良好。接种Ⅱ型GCRV至规模化培养的CiSB细胞,拷贝数最高达6.2×10^(5)拷贝数·μL^(-1)。研究结果可为草鱼出血病疫苗的规模化生产工艺研究提供依据。

关键词：草鱼鳔细胞(CiSB) Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒微载体培养工艺优化

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高体魳类结节病的病理组织学观察

水产学报 2013年第6期37卷 936-943页

作者：常藕琴石存斌任燕王芳吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所

实验使用组织病理学、活体压片和电镜技术,运用H.E常规染色法和美兰染色法对患有疑似类结节病的高体魳进行病理组织学诊断和观察。结果显示,患病高体魳肾脏和脾脏有大量白色小结节,直径大约1 mm;活体压片,观察到脾脏和肾脏中有散在短杆... 详细信息

实验使用组织病理学、活体压片和电镜技术,运用H.E常规染色法和美兰染色法对患有疑似类结节病的高体魳进行病理组织学诊断和观察。结果显示,患病高体魳肾脏和脾脏有大量白色小结节,直径大约1 mm;活体压片,观察到脾脏和肾脏中有散在短杆状细菌和大量呈团块状聚集的细菌结节;光学显微镜下,肾脏和脾脏有大量细菌聚集形成的嗜碱性结节,肾间质淤积的血液中也有大量细菌;透射电镜观察到肾脏和脾脏中有些巨噬细胞在吞噬细菌,有些菌体聚结成团形成结节,未见病毒颗粒。从病变组织中分离到两端极染的革兰氏阴性短杆菌,无鞭毛,长0.8～2.6μm,宽约0.6～1.2μm。患病高体魳器官主要组织病理学变化有肾小管上皮细胞变性坏死,肾间质淋巴细胞增生;脾淤血和淋巴细胞增生;肝细胞肿胀,脂肪变性。依组织病变、病原形态和特性,患病高体为类结节病。

关键词：高体魳类结节病病理组织学

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草鱼致病性类志贺邻单胞菌的分离与鉴定

微生物学报 2014年第2期54卷 229-235页

作者：胡钱东林强石存斌付小哲李宁求刘礼辉吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔药创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 大连海洋大学水产与生命学院辽宁大连116023 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心湖北武汉430070

【目的】分离鉴定引起草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉糜烂的类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigeloide)菌株JX-09。【方法】从患病草鱼分离致病菌,经形态学观察、人工感染试验、生理生化特性测定和16S rRNA基因序列分析对其进行分类... 详细信息

【目的】分离鉴定引起草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉糜烂的类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigeloide)菌株JX-09。【方法】从患病草鱼分离致病菌,经形态学观察、人工感染试验、生理生化特性测定和16S rRNA基因序列分析对其进行分类鉴定和致病性检验;同时对分离到的菌株做药物敏感性试验。【结果】从回归感染后的草鱼体内再次分离到菌株JX-09,表明该菌株为致病菌;菌株JX-09对草鱼的半致死量为6.4×104cfu/g。通过生化特征和分子系统学分析,将菌株JX-09鉴定为类志贺邻单胞菌。药敏试验表明该菌株对氨曲南、头孢唑林、头孢噻吩、头孢曲松等头孢类药物敏感,对卡那霉素、麦迪霉素、万古霉素和哌拉西林等耐药。【结论】类志贺邻单胞菌是草鱼肌肉糜烂病的致病菌,这是首次报道了该菌对草鱼有致病性。

关键词：类志贺邻单胞菌草鱼鉴定药敏试验

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

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水产学报 2023年第7期47卷 150-159页

作者：郜婷吴斯宇高彩霞夏苏东尹纪元王英英李莹莹石存斌王庆天津农学院水产学院中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔药创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗，实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35蛋白进行GCRV-VLPs的组装。实验将编码VP35蛋白的GCRV-s11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTATM，然... 详细信息

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗，实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35蛋白进行GCRV-VLPs的组装。实验将编码VP35蛋白的GCRV-s11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTATM，然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞，筛选得到重组穿梭质粒BacmidVP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHBVP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度，并通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示，实验获得了较高滴度的重组杆状病毒，并且重组蛋白在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达蛋白的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染Sf9细胞组装GCRVVLPs，通过透射电镜(EM)观察VLPs的组装情况。结果显示，GCRV-Ⅱ的3个蛋白在Sf9昆虫细胞中可以完成自我组装，形成与天然病毒结构形似的VLPs，直径为65～72 nm。本实验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定了基础。

关键词：草鱼草鱼呼肠孤病毒重组杆状病毒病毒样颗粒

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嗜水气单胞菌GYK1株培养基的优化

畜牧与兽医 2006年第11期38卷 29-31页

作者：陶家发吴淑勤潘厚军石存斌中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380

在营养肉汤培养基的基础上,经过一系列嗜水气单胞菌GYK1株培养试验,结果证明,成本价格较低的蔗糖、酵母膏可以代替葡萄糖、牛肉膏,从而降低培养基原料成本;添加少量的K2HPO4和微量元素溶液(Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+)可明显提高培养液的... 详细信息

在营养肉汤培养基的基础上,经过一系列嗜水气单胞菌GYK1株培养试验,结果证明,成本价格较低的蔗糖、酵母膏可以代替葡萄糖、牛肉膏,从而降低培养基原料成本;添加少量的K2HPO4和微量元素溶液(Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+)可明显提高培养液的活菌数;通过正交试验得到低成本、高得率的适合嗜水气单胞菌GYK1菌株生长的培养基配方,该培养基组成(g/L):蛋白胨10.0、酵母膏10.0、蔗糖15.0、K2HPO42.28;NaCl 5.0微量元素(硫酸镁0.1,硫酸亚铁0.04,硫酸锌0.00375,二氯化锰0.0021)。24 h摇瓶培养,菌液中的最高活菌数可达316×108cfu/mL,比营养肉汤培养基活菌数(151×108cfu/mL)提高100%以上。

关键词：嗜水气单胞菌培养基优化

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鳗鲡迟缓爱德华氏菌偶联疫苗免疫效果评价

免疫学杂志 2010年第2期26卷 102-107页

作者：潘鸿洧石存斌赵毅刘坡吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380 石河子大学动物科技学院新疆832003 陕西省动物疾病控制中心西安710016

目的迟缓爱德华氏菌是目前水产养殖中主要的病原菌,其感染谱甚广,危害巨大。因此,研制能有效预防这种致病菌的疫苗,将会极大的促进水产养殖业的发展。方法用OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC(福尔马林灭活全菌)以及生理盐水对照组按相同程... 详细信息

目的迟缓爱德华氏菌是目前水产养殖中主要的病原菌,其感染谱甚广,危害巨大。因此,研制能有效预防这种致病菌的疫苗,将会极大的促进水产养殖业的发展。方法用OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC(福尔马林灭活全菌)以及生理盐水对照组按相同程序分别免疫鳗鲡。通过溶菌酶活性检测、微量凝集反应试验,结果鳗鲡经OMP-LPS偶联物、OMP、LPS以及FKC疫苗免疫后,各免疫组间血清中溶菌酶活性没有显著差异(P>0.05),但均远高于生理盐水对照组(P<0.05);OMP-LPS偶联组抗迟缓爱德华氏菌(E.tarda)E29L株的抗体效价较单纯的LPS组、OMP组,FKC组抗体滴度高,且持续时间长;对迟缓爱德华氏菌(E.tarda)E29L株的攻击,OMP-LPS偶联组保护率为84%,高于单纯OMP组的80%,LPS组的44%和FKC组60%。结论 OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC添加佐剂ISA763,各组的溶菌酶活性均显著高于不添加佐剂各组(P<0.05),除了FKC+ISA763佐剂组外,其余各组均与不添加佐剂各组差异极显著(P<0.01),且添加佐剂各组保护率都明显高于不添加佐剂各组,说明添加ISA763佐剂能够更好的启动鱼类的特异性和非特异性免疫。

关键词：迟缓爱德华氏菌鳗鲡外膜蛋白脂多糖偶联疫苗

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风险分析在水生动物健康管理上的研究进展

江苏农业科学 2012年第1期40卷 195-199页

作者：杨淞李宁求石存斌吴淑勤中国水产科学院珠江水产研究所广东广州510380 上海海洋大学水产与生命科学学院上海201306 四川农业大学动物科技学院四川雅安625014

危害(hazard)是指可能对野生或养殖水生动物产生不利影响的任何一种病原。风险分析就是指对可能存在的危害的预测及在此基础上采取的规避或降低危害影响的措施。近年来,与水生动物相关的风险分析报道逐渐增多,主要集中在水产动物进出口... 详细信息

危害(hazard)是指可能对野生或养殖水生动物产生不利影响的任何一种病原。风险分析就是指对可能存在的危害的预测及在此基础上采取的规避或降低危害影响的措施。近年来,与水生动物相关的风险分析报道逐渐增多,主要集中在水产动物进出口、水产品检验检疫、寄生虫疾病传播、病毒传播等方面。笔者就目前风险分析的研究方法、基本程序以及在水产动物健康管理方面的研究进行了综述,以期为水生动物卫生防疫提供新的研究思路。

关键词：水产动物健康管理风险分析危害数学模型