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代谢工程大肠杆菌利用甘油高效合成L-乳酸

生物工程学报 2013年第9期29卷 1268-1277页

作者：田康明石贵阳路福平 Suren Singh 王正祥江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 天津科技大学生物工程学院天津3004574 德班理工大学生物工程与食品技术学院应用科学系

以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此,首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸... 详细信息

以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此,首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸脱氢酶(LdhA)的启动子片段PldhA。将两条DNA片段连接组成了表达盒PldhA-BcoaLDH。然后将上述表达盒通过同源重组删除FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶编码基因lldD的同时克隆入ldhA基因缺失菌株*** CICIM B0013-080C(ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA ldhA)的染色体上,获得了L-乳酸高产菌株*** CICIM B0013-090B(B0013-080C,lldD::PldhA-BcoaLDH)。考察了菌株CICIM B0013-090B不同培养温度下代谢利用甘油和合成L-乳酸的特征后,建立并优化了一种新型L-乳酸变温发酵工艺。在7 L发酵罐上,发酵27 h,积累L-乳酸132.4 g/L,产酸强度4.90 g/(L·h),甘油到L-乳酸的得率为93.7%,L-乳酸的光学纯度达到99.95%。

关键词： L-乳酸甘油 L-乳酸脱氢酶途径工程大肠杆菌

凝结芽孢杆菌CICIM B1821发酵生产L-乳酸的研究

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食品工业科技 2011年第10期32卷 245-248,276页

作者：田康明石贵阳王正祥江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物资源与生物能源研究中心江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心江苏无锡214122

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CICIM B1821是一株实验室前期筛选获得的产L-乳酸的嗜热菌。该菌株在34～55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性,50℃时获得最高的比生长速率和最大的乳酸积累量。CICIM B1821能够在pH为5.0～7.... 详细信息

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CICIM B1821是一株实验室前期筛选获得的产L-乳酸的嗜热菌。该菌株在34～55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性,50℃时获得最高的比生长速率和最大的乳酸积累量。CICIM B1821能够在pH为5.0～7.5的范围内保持高的菌体活性。氧气的存在有利于CICIM B1821的快速生长,但会导致副产物的积累,而在不通氧的条件下该菌株也生长良好,同时产酸速率可高达5.63g/L·h。控制残糖浓度不高于10%的发酵条件下,发酵48h,可积累乳酸107.5g/L,副产物总和仅为1.05g/L,葡萄糖对乳酸的得率为97.5%,所产L-乳酸光学纯度高于99%。此外,高浓度葡萄糖发酵实验显示,该菌株可在高渗透压下利用20%葡萄糖发酵生产L-乳酸,发酵100h,可积累乳酸134g/L,副产物总和仅为1.12g/L,葡萄糖对乳酸的得率为92.0%。

关键词：凝结芽孢杆菌嗜热菌 L-乳酸发酵生产

工业蛋白水解酶快速检测方法的建立与初步应用

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食品与发酵工业 2019年第17期45卷 216-220页

作者：宋鹏程磊田康明王正祥天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津科技大学化工与材料学院天津300457

蛋白水解酶是一类重要的工业酶制剂,快速检测蛋白水解酶活力对新蛋白酶的发现、生产与应用极为重要。基于荧光共振能量转移原理,用氟硼荧荧光素标记大豆分离蛋白,以此为底物建立了一种快速检测蛋白水解酶活力的新方法。运用此方法检测5... 详细信息

蛋白水解酶是一类重要的工业酶制剂,快速检测蛋白水解酶活力对新蛋白酶的发现、生产与应用极为重要。基于荧光共振能量转移原理,用氟硼荧荧光素标记大豆分离蛋白,以此为底物建立了一种快速检测蛋白水解酶活力的新方法。运用此方法检测5种工业蛋白酶,酶活在0.025~0.4U/mL与荧光值呈现良好的线性关系,检测限范围为1.1×10^-4~1.4×10^-4U/mL,定量限范围为3.7×10^-4~4.5×10^-4U/mL,相比国标福林法灵敏度提高20000倍以上。该方法灵敏度高、操作简便,在蛋白水解酶快速、微量检测及新型蛋白水解酶开发中具有应用潜力。

关键词：蛋白水解酶酶活检测大豆分离蛋白氟硼荧染料荧光标记

黑曲霉脂肪酶tglE的基因克隆与生化特征解析

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食品与发酵工业 2019年第21期45卷 1-7页

作者：丛珊滋田康明张新路福平王正祥天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津科技大学化工与材料学院天津300457 北京农学院农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京102206

从黑曲霉基因组中克隆了一种新的脂肪酶基因tglE,并在毕赤酵母中成功表达。重组酶具有典型的脂肪酶活性,其最适pH为7.0,最适温度为40℃;在30~60℃或pH 6.5~9.0该酶的酶活力保持在60%以上;在pH 6.0~8.0或20~30℃均较为稳定。Cu^2+、Mn^2+... 详细信息

从黑曲霉基因组中克隆了一种新的脂肪酶基因tglE,并在毕赤酵母中成功表达。重组酶具有典型的脂肪酶活性,其最适pH为7.0,最适温度为40℃;在30~60℃或pH 6.5~9.0该酶的酶活力保持在60%以上;在pH 6.0~8.0或20~30℃均较为稳定。Cu^2+、Mn^2+、Ca^2+、K^+、Mg^2+和Sn^2+对tglE有明显的激活作用;Fe^3+、Zn^2+和EDTA对重组酶的酶活抑制作用明显,特别是EDTA可抑制重组酶90%的活。tglE对橄榄油和C 4底物的作用最强,对棕果油和C 16底物的作用最弱。以C 4为底物,tglE的K m值为14.40 mmol/L,V max为46.72 mmol/(mL·h)。tglE具有催化辛酸和乙醇生成辛酸乙酯的酯化活性。

关键词：脂肪酶黑曲霉酶学性质酯化活性

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嗜热菌合成乳酸的研究

食品研究与开发 2009年第8期30卷 1-5页

作者：田康明石贵阳王正祥江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心江苏无锡214122

从467株原始菌株保藏物中筛选获得了产乳酸的嗜热菌29株。进一步复筛确定19株为产乳酸水平较高的嗜热菌,且均为Bacillus coagulans。采用高效液相色谱法对19株Bacillus coagulans的主要发酵产物进行分析。55℃下发酵54 h,总乳酸产量最... 详细信息

从467株原始菌株保藏物中筛选获得了产乳酸的嗜热菌29株。进一步复筛确定19株为产乳酸水平较高的嗜热菌,且均为Bacillus coagulans。采用高效液相色谱法对19株Bacillus coagulans的主要发酵产物进行分析。55℃下发酵54 h,总乳酸产量最高的为74.80 g/L,最低的为49.55 g/L。选择总乳酸产量较高的四株菌和产物中杂酸最少的一株菌作为进一步研究的菌株,分析所形成乳酸光学构型发现,5株菌所产L-乳酸的光学纯度均在98%以上,同时皆形成少量D-乳酸。

关键词：嗜热菌乳酸发酵

黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆与生化特征

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食品与发酵工业 2020年第1期46卷 30-35页

作者：苑馨瑶田康明金鹏程磊王正祥天津科技大学化工与材料学院天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457

低聚葡萄糖氧化酶能够氧化低聚葡萄糖末端残基生成相应的低聚糖酸,在低聚糖酸的制备、食品、化工等方面具有潜在的应用价值。从黑曲霉基因组中发现1个疑似编码低聚葡萄糖氧化酶开放读框,共编码473个氨基酸序列,包含2个保守结构域(FAD结... 详细信息

低聚葡萄糖氧化酶能够氧化低聚葡萄糖末端残基生成相应的低聚糖酸,在低聚糖酸的制备、食品、化工等方面具有潜在的应用价值。从黑曲霉基因组中发现1个疑似编码低聚葡萄糖氧化酶开放读框,共编码473个氨基酸序列,包含2个保守结构域(FAD结合域和黄素结构域)和4个活性位点(His80、Cys141、Asp377和Try428);在毕赤酵母中表达的重组酶蛋白大小为61 kDa,比酶活0.33 U/mg。重组酶的最适作用温度和pH值分别为75℃和9.0;在55~85℃和pH 5.0~9.0范围内孵育4 h,仍能保持70%以上的酶活;Mn^2+和Fe^3+分别对酶活具有最强的激活和抑制作用。该酶的K m和V max为0.48 mmol/L和2.22μmol/(L·min),对麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖具有相对较高酶活。

关键词：低聚葡萄糖氧化酶黑曲霉克隆表达酶学性质

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脂多糖减量合成对细胞外膜功能的影响

食品与发酵工业 2023年第24期49卷 15-20页

作者：李婧芳韩梦圆李铭心张濛田康明天津科技大学化工与材料学院天津300457

细胞生长、增殖和代谢过程中,个体间通过静电作用力或蛋白质间分子作用维持相对悬浮状态,有利于营养物质、底物和产物的传递。细胞培养完成或发酵结束后沉降方式收集细胞可以大幅度节约离心收集或板框过滤收集等方式所需要的设备和能量... 详细信息

细胞生长、增殖和代谢过程中,个体间通过静电作用力或蛋白质间分子作用维持相对悬浮状态,有利于营养物质、底物和产物的传递。细胞培养完成或发酵结束后沉降方式收集细胞可以大幅度节约离心收集或板框过滤收集等方式所需要的设备和能量消耗。细胞外膜作为维持个体细胞相对悬浮状态的主要细胞结构,其多糖组成和附着在多糖中的膜蛋白可能为细胞个体悬浮提供了相应的分子间作用力。考察细胞外膜中占比最高的脂多糖的减量合成及其可能对细胞自凝集过程的影响,将有助于实现菌体细胞的可控沉降。该研究以乳酸单体高产菌种大肠杆菌LG101为出发菌株,通过阻断脂多糖部分合成途径,构建脂多糖减量合成的新菌种LGL4A06。系统评价了新菌种脂多糖减量合成情况,以及对细胞结构、生长性能、代谢性能和自凝集性能等影响。结果显示,相比出发菌株,菌株LGL4A06脂多糖的含量降低了39.34%,单位OD 600菌体干重减少32.46%;与出发菌株不同,菌株LGL4A06在显微镜下细胞出现聚集,摇瓶培养条件下,菌体细胞最终积累量相当但比生长速率降低;摇瓶培养条件下的LGL4A06菌体细胞培养液,静置12 h菌体自凝集率可达83.20%,是出发菌株的13.9倍;通过不同温度和钙、镁离子添加对菌体自凝集特性的影响分析显示,自凝集特性与环境温度的相关性不显著,添加钙离子(10 mmol/L)和镁离子(10 mmol/L)静置4 h后,LGL4A06自凝集率分别提高了95.00%和83.00%,进一步提高了菌株自凝集速率。该研究证实通过减量合成脂多糖可以提高细胞自凝集效率,有助于实现菌体细胞的可控沉降,促进生物质分离过程,并降低发酵产品制备过程下游工艺的生产成本。

关键词：大肠杆菌细胞外膜脂多糖脂质A 自凝集

利用温度调节实现新型重组菌高效转化甘油为D-乳酸

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生物工程学报 2013年第1期29卷 111-114页

作者：田康明周丽陈献忠沈微石贵阳 Suren Singh 路福平王正祥江南大学生物工程学院江苏无锡214122 发酵粮食国家工程实验室江南大学江苏无锡214122 德班理工大学生物工程与食品技术学院应用科学系天津科技大学生物工程学院天津300457

油脂水解来源的甘油将是未来发酵工业主要原料之一。文中探索D-乳酸高产大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013-070菌株不同培养温度下好氧与厌氧代谢甘油的特征后,建立并优化了一种新型D-乳酸变温发酵工艺,甘油到乳酸的得率由64%提高到... 详细信息

油脂水解来源的甘油将是未来发酵工业主要原料之一。文中探索D-乳酸高产大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013-070菌株不同培养温度下好氧与厌氧代谢甘油的特征后,建立并优化了一种新型D-乳酸变温发酵工艺,甘油到乳酸的得率由64%提高到82.6%。另外,在B0013-070中引入了温度诱导型乳酸脱氢酶的转录系统,甘油到乳酸的得率进一步提高到88.9%。

关键词： D-乳酸甘油变温发酵

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毕赤酵母热致死动力学模型的建立与检验

天津科技大学学报 2017年第2期32卷 24-29页

作者：田康明段威王正祥路福平天津科技大学化工与材料学院天津300457 工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

毕赤酵母作为最成熟的蛋白质过量表达平台微生物之一,广泛应用于酶制剂、功能性大分子等大宗产品的发酵制造.建立毕赤酵母常规温度下(50~60,℃)的热致死动力学模型,有助于指导毕赤酵母发酵制造体系的菌体后处理工艺,增加菌体利用价值.... 详细信息

毕赤酵母作为最成熟的蛋白质过量表达平台微生物之一,广泛应用于酶制剂、功能性大分子等大宗产品的发酵制造.建立毕赤酵母常规温度下(50~60,℃)的热致死动力学模型,有助于指导毕赤酵母发酵制造体系的菌体后处理工艺,增加菌体利用价值.为了建立毕赤酵母在50~60,℃条件下热致死动力学模型,将不同菌体量的毕赤酵母菌液在50、55、60,℃条件下进行不同时间热灭活处理,通过平板培养活细胞计数的方法评价不同处理方式下毕赤酵母的热致死效果,得到的致死曲线用Weibull模型和多元回归方程进行拟合构建热致死动力学模型,并对建立的模型进行数学检验和实用性检验.结果表明:建立的毕赤酵母热致死动力学模型可靠,具有实际使用价值.本研究所建立的模型能较好地模拟不同温度、不同处理时间对不同菌体量的毕赤酵母热致死效果的影响.并可以为毕赤酵母热灭活处理条件的确定提供计算依据.

关键词：毕赤酵母致死动力学预测微生物学 Weibull模型