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作者：王秦豪第四军医大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚... 详细信息

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚基构成,两亚基以二硫键连接。其中α亚基负责与胞外配体结合,β亚基含有激酶催化结构域和多个磷酸化位点。当配体结合或因过度表达而导致受体活化时,β亚基胞内多个位点发生磷酸化,从而募集下游含有PTB结构域的胰岛素受体底物1/2(Insulin Receptor Substrate 1/2, IRS-1/2)等接头分子,进而激活下游MAPK和PI-3K等信号通路,促进细胞增殖、转移和侵袭,抑制细胞凋亡,加速肿瘤细胞的恶性转化。胰岛素受体(Insulin Receptor, InsR)作为细胞发生恶性转化的“帮凶”,与IGF-1R具有同样的胞内接头分子,介导相同的细胞信号通路,引起类似的细胞效应。因此,IGF-IR和InsR是抗肿瘤治疗的理想靶位。泛素化介导的蛋白质降解过程,是细胞内蛋白质负向调节的主要方式。泛素化反应过程是在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)的协同作用下,使被降解的蛋白发生泛素化,进而在蛋白酶体或溶酶体中降解。其中E3是蛋白质降解的关键连接蛋白,它能够特异性识别与结合底物,并将泛素转移至底物。本研究中利用具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域和Cbl的RING结构域行使降解功能,下调靶蛋白IGF-IR和InsR的水平,达到抑制肿瘤的目的。在本研究的第一部分实验中,我们通过重组PCR,将IRS-1蛋白中能够与磷酸化的IGF-IR和InsR结合的PTB结构域(Phosphotyrosine Binding domain)的基因与CHIP的U-box结构域基因或者Cbl的RING结构域基因进行基因融合,将融合基因插入真核表达载体pFLAG-CMV4,构建重组泛素连接酶。在第二部分实验中,我们检测了重组泛素连接酶在几种肿瘤细胞系中的表达和对靶蛋白的降解作用。研究的第三部分,着重考察了重组泛素连接酶对HeLa细胞的增殖和转移能力的影响。实验一:设计引物,利用普通PCR分别扩增IRS-1的PTB结构域基因、CHIP的U-box结构域基因和Cbl的RING结构域基因,PTB的下游引物与U-box、RING的上游引物设计了几个连续的反向互补序列,利用重组PCR可将PTB与U-box、PTB与RING进行基因融合,获得的产物分别命名为PTB-U-box和PTB-RING。将融合基因产物进行EcoR I、EcoR V双酶切处理,插入真核表达载体pFLAG-CMV4。经过酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒命名为pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING,以及功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB。实验二:将构建成功的重组泛素连接酶转染几种IGF-IR和InsR高表达的肿瘤细胞系,包括SK-Br-3、HepG2、HHCC以及HeLa,设立pFLAG-CMV4-PTB- U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-PTB和空载体pFLAG-CMV4为阴性对照,检测重组泛素连接酶在其中的表达,以及对靶蛋白水平的下调情况,结果显示两种重组泛素连接酶均能促使靶蛋白发生不同程度的下调。同时设计引物,进行Real-time PCR实验,检测重组泛素连接酶的导入,对靶蛋白的mRNA水平是否造成影响,以确定靶蛋白丰度的降低是在翻译后水平产生的。实验三:随后选取了降解效果最明显的HeLa细胞进行细胞学实验,设立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING为实验组,pFLAG-CMV4 -PTB、和pFLAG-CMV4为阴性对照,MTT比色实验、平板克隆形成实验检测重组泛素连接酶对肿瘤细胞的增殖能力的影响,Transwell实验检测其对细胞转移侵袭能力的影响。结果显示,两种重组泛素连接酶能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭能力。综上所述,在多种肿瘤细胞中都存在RTK的异常活化和过度表达,靶向降解这些分子是行之有效的抑制肿瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成员,参与肿瘤细胞的恶性转化。它们的下调能够抑制肿瘤的发展,所以成为肿瘤治疗中的理想靶位。泛素化是一种常见的翻译后修饰方式,经典的泛素化修饰介导蛋白质的泛素-蛋白酶体降解途径,使被修饰的底物蛋白发生降解。利用能够特异结合IGF-1R和InsR的接头分子的受体结合域实现重组泛素连接酶的靶向性,E3泛素连接酶的催化域实现

关键词：胰岛素样生长因子受体胰岛素受体 PTB结构域 U-box结构域 RING结构域肿瘤基因治疗靶向性泛素化

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基于生物信息学的抑癌基因NDRG2相互作用蛋白预测及验证

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中国生物化学与分子生物学报 2013年第2期29卷 168-174页

作者：牛天水刘学武李霞茹懿王秦豪张璟第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安710032

NDRG2(N-Myc downstream regulator gene 2)是NDRG家族成员之一.以往研究表明,该家族与细胞的增殖和分化有关.而该分子参与的细胞信号通路及调节机制尚未阐明.本研究利用保守蛋白间相互作用(interologs)的生物信息学方法预测NDRG2相互... 详细信息

NDRG2(N-Myc downstream regulator gene 2)是NDRG家族成员之一.以往研究表明,该家族与细胞的增殖和分化有关.而该分子参与的细胞信号通路及调节机制尚未阐明.本研究利用保守蛋白间相互作用(interologs)的生物信息学方法预测NDRG2相互作用分子,并通过免疫共沉淀(Co-IP)及His pull-down蛋白体外结合实验方法对预测结果进行验证.生物信息学软件预测和分析结果表明,细胞中存在多个可能与NDRG2发生相互作用分子.结合文献报道,从中选取了3个候选分子Gnb1、Rgs16及Rgs5进行分子生物学实验验证.Co-IP及His pull-down实验结果表明,3个候选分子中,Rgs5蛋白能够和NDRG2蛋白相互作用,而其它2个候选分子与NDRG2的相互作用未获得实验室方法的验证.研究结果表明,生物信息学分析与实验室验证相结合是一种高效省时的蛋白质相互作用研究策略.通过这种策略证实NDRG2可以与Rgs5蛋白相互作用,为后续NDRG2功能的研究提供了有效的线索.

关键词：生物信息学 NDRG2 蛋白质相互作用

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迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定共表达HCT116^(MIIP-Luc)结肠癌细胞系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2018年第2期34卷 136-140页

作者：熊欣颜广王秦豪茹懿严奉奇李霞第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032

目的建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系,为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法将MIIP基因插入慢病毒载体p LEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体p LEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体p LEX-M... 详细信息

目的建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系,为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法将MIIP基因插入慢病毒载体p LEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体p LEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体p LEX-MCS-HA-MIIP及包装载体VSVG、△8.9,共转染HEK293T细胞,包装表达MIIP的慢病毒,将其感染HCT116细胞后,采用适宜浓度的嘌呤霉素筛选,建立MIIP稳定过表达的HCT116细胞。利用表达荧光素酶报告基因的慢病毒进行二次感染,建立MIIP和荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞。利用实时荧光定量PCR检测MIIP的mRNA水平,Western blot法检测MIIP蛋白水平,小动物活体成像技术观察HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞的荧光强弱。结果成功建立了MIIP荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞,在HCT116MIIP-Luc细胞中实现了MIIP过表达,生物发光成像结果显示HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞均可产生较强的荧光。结论分别建立了可传代的MIIP过表达及荧光素酶报告基因稳定共表达的结肠癌HCT116细胞株。

关键词：结肠癌迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP) 荧光素酶报告基因慢病毒感染

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程序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)的翻译后修饰调控及其在肿瘤免疫治疗中的应用进展

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第11期38卷 1036-1043页

作者：苏媛媛王秦豪茹懿董健李霞张正祥延安大学医学院药理学教研室陕西延安716000 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室肿瘤生物学国家重点实验室陕西西安710032

程序性细胞死亡蛋白1配体1/程序性细胞死亡蛋白1(PD-L1/PD-1)免疫检查点是最有前景的肿瘤免疫治疗靶点之一。肿瘤等细胞表面过度表达的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1结合,抑制T细胞活化,导致肿瘤免疫逃逸;靶向PD-1/PD-L1的治疗策略主要通... 详细信息

程序性细胞死亡蛋白1配体1/程序性细胞死亡蛋白1(PD-L1/PD-1)免疫检查点是最有前景的肿瘤免疫治疗靶点之一。肿瘤等细胞表面过度表达的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1结合,抑制T细胞活化,导致肿瘤免疫逃逸;靶向PD-1/PD-L1的治疗策略主要通过阻断二者结合,恢复免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。肿瘤细胞中PD-L1的水平与功能受到多层次的调控,其中,PD-L1的翻译后修饰(PTM)近年来备受关注,主要包括糖基化、磷酸化、泛素化、乙酰化以及棕榈酰化修饰等,这些修饰方式能够影响PD-L1的稳定性、细胞内定位或功能,进而调控T细胞活化和肿瘤免疫,因而干预PD-L1的PTM亦可作为新的抗肿瘤免疫逃逸治疗手段。

关键词：肿瘤免疫治疗程序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1) 翻译后修饰综述

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IGFBP-2的结构功能与调控及其与肿瘤关系的研究进展

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现代生物医学进展 2015年第22期15卷 4380-4383页

作者：何威良王秦豪李霞肿瘤生物学国家重点实验室第四军医大学生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032

IGFBP-2作为IGFBP超家族最受关注的分子之一,在多种肿瘤中都发现其表达增加,通过调控肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭以及内皮募集和血管生成等多种过程,在肿瘤的发生与发展中起着重要作用。IGFBP-2的功能复杂多样,受细胞类型与细胞微环境... 详细信息

IGFBP-2作为IGFBP超家族最受关注的分子之一,在多种肿瘤中都发现其表达增加,通过调控肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭以及内皮募集和血管生成等多种过程,在肿瘤的发生与发展中起着重要作用。IGFBP-2的功能复杂多样,受细胞类型与细胞微环境的影响,其表达含量与肿瘤进程关系紧密,并且与抑癌基因PTEN的表达呈反相关。本文综述了IGFBP-2蛋白结构、功能、调控及其与肿瘤关系的研究进展,为将IGFBP-2作为新的肿瘤治疗靶点提供依据。

关键词： IGFBP-2 肿瘤 IGF 侵袭血管生成

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RAD51促进神经胶质母细胞瘤增殖和迁移并降低其对替莫唑胺的敏感性

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细胞与分子免疫学杂志 2019年第9期35卷 817-822页

作者：李岐茹懿王秦豪吕伟峰胡伟费舟李霞林伟空军军医大学西京医院神经外科陕西西安710032 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032

目的研究DNA损伤修复基因Rad51重组酶(RAD51)在胶质瘤细胞系U251细胞增殖、迁移及在替莫哩胺(TMZ)化疗敏感性中的作用,并探讨其分子机制。方法TCGA数据库分析RAD51在胶质瘤中表达变化;在U251胶质瘤细胞中,利用慢病毒过表达或敲低RAD51... 详细信息

目的研究DNA损伤修复基因Rad51重组酶(RAD51)在胶质瘤细胞系U251细胞增殖、迁移及在替莫哩胺(TMZ)化疗敏感性中的作用,并探讨其分子机制。方法TCGA数据库分析RAD51在胶质瘤中表达变化;在U251胶质瘤细胞中,利用慢病毒过表达或敲低RAD51或应用小分子抑制剂抑制其活性,通过CCKW法和克隆形成实验检测胶质瘤细胞增殖;细胞划痕实验检测其迁移能力,CCK-8法、流式细胞术分析RAD51表达变化对胶质瘤细胞TMZ敏感性的影响,Western blot法检测P53蛋白表达改变。结果胶质瘤组织中RAD51表达明显升高;RAD51可增强胶质瘤细胞系U251细胞的增殖和迁移能力;敲低RAD51后可增强胶质瘤细胞对TMZ的敏感性;过表达RAD51后细胞P53蛋白表达升高,敲低RAD51后P53表达减少。结论RAD51在胶质瘤中发挥癌基因功能,过表达后明显增强胶质瘤细胞的增殖、迁移能力,敲低RAD51可增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。

关键词：胶质母细胞瘤化疗肿瘤增殖 Rad51重组酶(RAD51)

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重组泛素连接酶tTRIP-U-box的构建与表达

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现代生物医学进展 2013年第27期13卷 5205-5208页

作者：钟代星王秦豪茹懿药立波李霞第四军医大学生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032

目的:构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF(TNF Receptor Associated Factor)家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法:分别设计引物,扩增tTRIP(TRAF-interacting pro... 详细信息

目的:构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF(TNF Receptor Associated Factor)家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法:分别设计引物,扩增tTRIP(TRAF-interacting protein)分子C端伸展的coiled-coiled结构域以及E 3泛素连接酶CHIP的U-box结构域,再利用重组PCR,将tTRIP与U-box进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG-CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK-293T细胞系,Western印迹验证重组质粒的表达。结果:PCR结果显示tTRIP截短分子和tTRIP-U-box条带大小分别为660bp和1188bp,重组质粒经酶切鉴定和测序证实正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论:成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4-tTRIP-U-box,并且转染HEK-293T细胞系后证实其能够正确表达。

关键词：重组泛素连接酶破骨细胞基因表达

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Kruppel样因子17抑制肾癌786-0细胞迁移和侵袭及机制

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中华实验外科杂志 2016年第12期33卷 2672-2674页

作者：严奉奇王秦豪茹懿李霞武国军第四军医大学西京医院泌尿外科西安710032 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安710032

目的探讨Kruppe1样因子17（KLF17）是否通过调控上皮-间充质转化（EMT）抑制786-0细胞的迁移侵袭能力。方法设计并合成特异性小干扰RNA（siRNA）下调肾癌细胞株786-0中KLF17的表达，并利用划痕实验及Transwell实验检测其迁移侵袭能力的... 详细信息

目的探讨Kruppe1样因子17（KLF17）是否通过调控上皮-间充质转化（EMT）抑制786-0细胞的迁移侵袭能力。方法设计并合成特异性小干扰RNA（siRNA）下调肾癌细胞株786-0中KLF17的表达，并利用划痕实验及Transwell实验检测其迁移侵袭能力的变化，通过Westernblot检测EMT相关分子表达水平变化。结果siRNA能有效下调肾癌786-0细胞株中KLFl7的蛋白及mRNA的表达量。细胞划痕实验结果显示下调KLF17表达后，细胞迁移能力增强（P〈0．01）；Transwell实验中阴性对照组穿膜细胞数为（18．16±2．21）个，而siRNA1组为（29．03±2．48）个（P〈0．01），siRNA2组为（28．93±3．00）个（P〈0．01）。KLF17-siRNA介导的基因沉默下调了上皮细胞表面标记E-钙黏蛋白（E-cadberin）、β-连环蛋白（β-catenin）的表达，上调了间充质干细胞表面标记N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达。结论KLF17可通过调节EMT的进程影响肾癌细胞的迁移侵袭能力。

关键词：肾癌 Krtippel样因子17 迁移侵袭上皮一间充质转化

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pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒真核表达载体的构建

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现代生物医学进展 2013年第8期13卷 1408-1411,1455页

作者：李瑗春茹懿王秦豪李霞白庆咸第四军医大学西京医院血液内科陕西西安710032 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032

目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础。方法:pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-)。... 详细信息

目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础。方法:pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-)。首先通过PCR扩增出Bcr-a片段,将其克隆入pcDNA3.1(-)的NheI/XhoI之间;接着将PCR扩增出的Abl-c片段克隆入KpnI/HindIII之间,最后XhoI/KpnI双酶切pGD210,将酶切下片段插入pcDNA3.1(-)的相应位点即可。酶切鉴定及测序正确后,转染293T细胞,Western blot验证质粒的表达。pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的突变质粒:首先设计引物,第一步以pcDNA3.1(-)-BCR/ABL为模板,以Abl-c-u和ba-M1为引物扩增出A-1:560 bp。第二步,相同模板,以ba-M2和ba-M-down为引物扩增出A-2:870 bp。第三步,以扩增出的A-1和A-2为模板,以Abl-c-u和ba-M-down为引物,扩增出1434 bp的片段A-1+2,以Bcl和Kpn I分别酶切pcDNA3.1(-)-BCR/ABL以及A-1+2,将突变后的A-1+2置换入pcDNA3.1(-)-BCR/ABL。结果:PCR结果显示3.1(-)-Bcr-Abl及3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒条带大小符合,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论:成功构建pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的真核表达载体,并且转染293T细胞后证实其能够正确表达,为后续研究奠定了基础。

关键词： pcDNA3 1(-)-Bcr-Abl pcDNA3 1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒重组质粒 CML 分段PCR

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生物化学“TCA”特色课程思政模式的构建与应用

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第6期39卷 896-902页

作者：赵晶梁亮魏仁吉王秦豪张翔贾林涛阴继凯高彬林燕空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室西安710032 空军军医大学第二附属医院普通外科西安710038 空军军医大学第二附属医院内分泌科西安710038 空军军医大学第二附属医院儿科西安710038

高等教育“四新”建设(新工科、新医科、新农科、新文科)背景下,生物化学课程思政建设质量直接关乎育人成效。本校经过6年生物化学课程思政教学实践,以学科重要名词三羧酸循环中的“TCA”(三羧酸)类比育人的“一心三力”(T-思考力与合... 详细信息

高等教育“四新”建设(新工科、新医科、新农科、新文科)背景下,生物化学课程思政建设质量直接关乎育人成效。本校经过6年生物化学课程思政教学实践,以学科重要名词三羧酸循环中的“TCA”(三羧酸)类比育人的“一心三力”(T-思考力与合作力、C-鉴别力、A-敬畏心),由此提出生物化学大学科通用的“TCA”特色思政理念,分别引导学生建立正确的认知观、科学观和生命观。同时构建了实现该理念、具有可操作性的实践创新体系,包括“一课三融”教的理念、“成长三思”学的理念、“创学三境”深度学习环境序贯创设,能够满足不同学校学情进而灵活设计高阶教学活动的基本需求。本校应用该模式,构建了突显军医大学特色的“TCA白兰鸽”生物化学思政体系,“白”代表医学,“兰”代表空军,“鸽”代表和平和谐。运用上述教与学的理念、学习环境序贯创设方法,个性化设计瞄准高阶育人目标的三大教学活动,包括“魔力生化圈”共学平台,注重主动建构与个性输出的思维训练;“基础-临床双师大班互动”启学课堂,侧重深度思考与讨论迭代的思辨表达;“虚拟仿真(VR)沉浸式任务”乐学应用,关注应对复杂与纠错担当的思感升华。上述“TCA白兰鸽”育人效果较满意,学生的整合思维、深度学习、反思迭代等高阶能力得到切实锻炼,但同时在实施过程中也遇到一些问题,尚待提出有效的解决思路。

关键词：生物化学 TCA思政模式思考力合作力鉴别力敬畏心

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