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狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内的质控方法

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中国生物制品学杂志 2007年第3期20卷 213-215页

作者：王泽鋆胡巧玲徐葛林武汉生物制品研究所基因工程室武汉430060

目的探讨狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控方法。方法以ELISA双抗体夹心法检测狂犬病病毒抗原为例,采用“Levey-Jennings”和“即刻法”质控法进行对比。结果“Levey-Jennings”质控图中所有测定结果均处于“在控状态”,而... 详细信息

目的探讨狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控方法。方法以ELISA双抗体夹心法检测狂犬病病毒抗原为例,采用“Levey-Jennings”和“即刻法”质控法进行对比。结果“Levey-Jennings”质控图中所有测定结果均处于“在控状态”,而“即刻法”质控图中一次测定结果处于“失控状态”。结论宜采用双质控方法进行狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控。

关键词：狂犬病病毒核衣壳抗原试剂盒质量控制

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人肠道病毒71型VP4多抗的制备及其应用

中国生物制品学杂志 2016年第3期29卷 300-303,307页

作者：任富利周辉王泽鋆孟胜利申硕武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室湖北武汉430207

目的制备人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP4多抗,并鉴定EV71空心颗粒(empty particle,EP)和实心颗粒(full particle,FP)。方法构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP4,诱导表达并纯化GST-VP4融合蛋白,免疫家兔制备多抗。ELISA法检测抗体效价,免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot法鉴定抗体特异性。应用制备的多抗经Western blot法区分EV71 EP与FP。结果质粒p GEX-6p-1-VP4经双酶切及测序鉴定证明构建正确,纯化后的GST-VP4融合蛋白相对分子质量约32 000,以包涵体形式存在。免疫家兔后可获得效价达10^(10)的多抗。兔抗EV71 VP4多抗可识别EV71原核表达及天然病毒颗粒中的VP0、VP4。结论抗EV71 VP4多抗可应用于EV71 EP及FP的鉴定,为EV71的基础研究及疫苗研发提供了新的工具及方法。

关键词：肠道病毒71型 VP4 多克隆抗体

柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备、纯化及鉴定

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中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 782-787页

作者：禹玉婷胡岗罗志宇卢佳王泽鋆孟胜利申硕武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430070

目的制备柯萨奇病毒A2(Coxsackievirus A2,CV-A2)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并对其进行纯化及鉴定。方法将CV-A2 P1和3CD基因序列根据昆虫细胞偏好特性进行密码子优化并人工合成,分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体... 详细信息

目的制备柯萨奇病毒A2(Coxsackievirus A2,CV-A2)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并对其进行纯化及鉴定。方法将CV-A2 P1和3CD基因序列根据昆虫细胞偏好特性进行密码子优化并人工合成,分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(pPh)和pP10启动子后,构建重组质粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD,转化至大肠埃希菌(***)DH10 Bac^(TM)中,转座形成重组bacmid,再将重组bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBacCV-A2 P1-3CD,经蔗糖垫底离心和氯化铯密度梯度离心法纯化rCV-A2 VLPs,SDS-PAGE、Western blot法检测浓度及纯度,透射电镜法观察VLPs颗粒形态。结果质粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD经双酶切鉴定,重组Bacmid、rCV-A2VLPs经PCR鉴定,均在预期目标条带处可见清晰条带;rCV-A2 P1-3CD蛋白经IFA鉴定可见明显荧光;rCV-A2 VLPs经SDS-PAGE及Western blot分析,均可见清晰的VP0(相对分子质量约39000)、VP1(相对分子质量约34000)和VP3(相对分子质量约27000)条带;透射电镜观察纯化rCV-A2 VLPs,可见直径2333 nm的颗粒,形态和大小与CV-A2一致。结论成功构建了pFastBacDualCV-A2 P1-3CD重组Bacmid质粒,并成功表达了rCV-A2 VLPs,为今后rCV-A2 VLPs疫苗的研发奠定了基础。

关键词：柯萨奇病毒A2 病毒样颗粒 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统纯化

一起疑似无菌性脑膜炎暴发疫情样本中肠道病毒的分子检测与序列分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2019年第8期39卷 596-600页

作者：章光明麦健仪王泽鋆孟胜利庞志峰陈梦安申硕金华市疾病预防控制中心传染病防制科 321002 武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室 430207 武汉生物制品研究所有限责任公司国家联合疫苗工程技术研究中心 430207

目的对一起发生于浙江金华市某幼儿园的疑似无菌性脑膜炎疫情样品进行肠道病毒的分子检测及序列分析。方法抽提病毒RNA并逆转录,利用肠道病毒通用引物分别扩增病毒基因组的5′-非翻译区(untranslated region,UTR)及VP1基因部分片段。通... 详细信息

目的对一起发生于浙江金华市某幼儿园的疑似无菌性脑膜炎疫情样品进行肠道病毒的分子检测及序列分析。方法抽提病毒RNA并逆转录,利用肠道病毒通用引物分别扩增病毒基因组的5′-非翻译区(untranslated region,UTR)及VP1基因部分片段。通过比较VP1基因片段的同源性对病毒进行分型,并利用MEGA6软件对病毒VP1基因片段进行系统发育树分析。结果7名发病患者及26名无症状学生中,48.5%为柯萨奇病毒A10型(coxsakievirus A10,CV-A10)感染,21.2%为埃可病毒6型(echovirus 6,Echo 6)感染,12.1%可能存有两种病毒共感染的情况。7名发病患者中,6名患者的检测结果为CV-A10感染,而另外1名可能为两种病毒共感染。系统发育树分析中本研究的CV-A10病毒株与近年来中国大陆地区CV-A10流行株亲缘关系较近,如2015年厦门株、2017年云南株等。而Echo 6病毒株与2014年中国云南、广州、山东的Echo 6流行株亲缘关系较近。结论本次疑似无菌性脑膜炎暴发疫情样品中主要检测到CV-A10及Echo 6两种肠道病毒血清型,且两种血清型的病毒株与近年来中国大陆地区相应血清型的流行株亲缘关系较近。

关键词：无菌性脑膜炎肠道病毒柯萨奇病毒A10型埃可病毒6型

柯萨奇病毒A6病毒样颗粒的制备及免疫原性初步研究

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病毒学报 2020年第6期36卷 1067-1074页

作者：陈静李波李鹏飞陈易吴杰王泽鋆孟胜利申硕三峡大学医学院宜昌443002 三峡大学附属仁和医院宜昌443003 武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究一室武汉430207

手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一种常见传染病,以婴幼儿发病为主,柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是引起HFMD暴发的主要病原体,其疫苗开发有待深入的研究,而病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是潜在安全的候选疫苗。为制备CV-A6 VLPs,并研究其免疫原性,本研究利用Bac-toBac昆虫细胞杆状病毒表达系统共表达P1和3CD蛋白,制备并纯化CV-A6 VLPs,应用间接免疫荧光试验(Indirect immunofluscent assay,IFA)、SDS-PAGE、Western Blot、透射电镜法等方法鉴定。以Al(OH)3为佐剂,三种不同剂量CV-A6 VLPs免疫BALB/c小鼠,采用微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体滴度。结果显示,重组有P1和3CD的杆状病毒质粒转染Sf9细胞,可形成CV-A6类病毒颗粒,直径约为26nm。SDS-PAGE和Western Blot结果说明P1前体蛋白被3CD作用切割产生了VP0、VP1和VP3,CV-A6 VLPs由这三个病毒结构蛋白构成。小鼠免疫实验结果显示,CV-A6 VLPs可以刺激产生较高水平抗CV-A6的特异性中和抗体,维持至少12周,并且抗体中和效价与免疫剂量和免疫次数呈正相关。本研究获得重组杆状病毒rBac-CV-A6-P1-3CD,并在Sf9细胞内成功表达CV-A6 VLPs,可以刺激小鼠产生较高水平和持久的体液免疫反应。

关键词：柯萨奇病毒A组6型(CV-A6) 病毒样颗粒(VLPs) 昆虫细胞杆状病毒表达系统

柯萨奇病毒A6型VP1和VP2基因的原核表达及多克隆抗体制备

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中华实验和临床病毒学杂志 2018年第6期32卷 640-645页

作者：陈静李鹏飞吴杰孟胜利申硕王泽鋆三峡大学医学院宜昌443002 武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究一室 430207

目的构建柯萨奇病毒A6型(coxsackie virusA6,CVA6)VP1和VP2基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备抗CVA6VP1和VP2兔抗血清。方法逆转录PCR扩增CVA6VP1和VP2基因片段,整合入表达载体pGEX-6p-1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半... 详细信息

目的构建柯萨奇病毒A6型(coxsackie virusA6,CVA6)VP1和VP2基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备抗CVA6VP1和VP2兔抗血清。方法逆转录PCR扩增CVA6VP1和VP2基因片段,整合入表达载体pGEX-6p-1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,经过大型SDS-PAGE制备电泳并进行切胶回收纯化,纯化后的融合蛋白GST-VP1和GST-VP2分别免疫家兔,获得兔抗血清。Westernblot(WB)和间接免疫荧光试验(indirectimmunofluorescence assay,IFA)鉴定抗体。结果CVA6VP1和VP2原核表达载体经PCR、双酶切和测序鉴定正确,获得了高纯度的CVA6VP1和VP2融合蛋白,WB和IFA鉴定多克隆抗体制备成功。结论成功构建了CVA6VP1和VP2原核表达载体,获得了重组的CVA6VP1和VP2蛋白及其多克隆抗体。

关键词：柯萨奇病毒A6型 VP1 VP2 原核表达多克隆抗体

2019年EV-A71疫苗接种地区手足口病肠道病毒分子流行病学分析

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中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 843-848,852页

作者：杨祥徐长征陈金华孟胜利王泽鋆申硕陈晓琦武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室湖北武汉430207 国家联合疫苗工程技术研究中心湖北武汉430207

目的分析2019年EV-A71疫苗在湖北省潜江市和谷城县两地区接种后,手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)相关肠道病毒病原谱结构及分子流行病学特征。方法采集谷城县2019年6—12月和潜江市2019年5—12月HFMD患儿肛拭子标本,通过多... 详细信息

目的分析2019年EV-A71疫苗在湖北省潜江市和谷城县两地区接种后,手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)相关肠道病毒病原谱结构及分子流行病学特征。方法采集谷城县2019年6—12月和潜江市2019年5—12月HFMD患儿肛拭子标本,通过多通道real-time RT-PCR技术对肠道病毒阳性样本进行初步分型筛选后,采用常规RT-PCR方法对肠道病毒VP1区部分基因扩增测序,通过DNAStar 7.0、MEGA 6.0等软件进行分子进化特征分析。结果共收集谷城县2019年6—12月和潜江市2019年5—12月HFMD样本520份,检出肠道病毒阳性样本490份,阳性率94.23%。其中谷城县检出肠道病毒阳性样本242份,共检出6种肠道病毒,各病原及构成比分别为CV-A684.30%、CV-A162.48%、CV-A107.44%、CV-A53.31%、CV-A40.83%、CV-A80.41%、其他未定型的肠道病毒(other enterovirus,other EV)1.24%;潜江市检出肠道病毒阳性样本248份,共检出4种肠道病毒,各病原及构成比分别为CV-A654.80%、CV-A1640.4%、CV-A54.40%、CV-A80.40%。对几种主要流行的病原基于VP1分子进化树分析结果表明,谷城县和潜江市两地区的CV-A6均属于D3亚型,谷城县CV-A10属于C亚型,潜江市CV-A16属于B1b亚型,谷城县CV-A16属于B1a亚型。结论2019年下半年,谷城县和潜江市两地区在EV-A71疫苗的干预下,HFMD病原谱为多种基因型的肠道病毒共同流行,其中CV-A6为优势病原体,未发现由EV-A71病原引起的HFMD,表明EV-A71疫苗的接种在接种地区形成了良好的保护效果。

关键词： EV-A71疫苗手足口病肠道病毒分子流行学病原学

柯萨奇病毒A组16型实壳病毒颗粒与空壳病毒颗粒免疫原性的比较

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中国生物制品学杂志 2015年第11期28卷 1132-1137页

作者：张夫坤卢佳吴杰王泽鋆季雅琪郑晓丽申硕武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430000 长春祈健生物制品有限公司吉林长春130000

目的比较柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CVA16）实壳病毒颗粒（full particle,FP）和空壳病毒颗粒（empty particle,EP）的免疫原性。方法以CVA16病毒株CVA16-L731感染Vero细胞,采用10层细胞工厂培养工艺培养病毒,收获液经离... 详细信息

目的比较柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CVA16）实壳病毒颗粒（full particle,FP）和空壳病毒颗粒（empty particle,EP）的免疫原性。方法以CVA16病毒株CVA16-L731感染Vero细胞,采用10层细胞工厂培养工艺培养病毒,收获液经离心纯化后,用甲醛灭活,获得灭活纯化的CVA16-L731 FP和EP。采用BCA法检测CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度,4%~12%SDS-PAGE、Western blot及透射电镜对CVA16-L731 FP和EP进行鉴定。以氢氧化铝为佐剂,分别以EP、FP、EP/FP为抗原,于第0、14、28天经后肢肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,于0、7、21、35、49、63、77、91 d对小鼠进行眼眶采血。采用微量中和试验法检测免疫小鼠血清中和抗体滴度,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,母传抗体保护试验检测CVA16-L731 FP和EP的垂直保护效果。结果纯化后的CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度分别达到420和150μg/ml;CVA16-L731 FP可见4条相对分子质量分别约为34 000（VP1）、26 000（VP2）、24 000（VP3）和8 000（VP4）的条带,CVA16-L731 EP可见3条相对分子质量分别约为36 000（VP0）、34 000（VP1）和24 000（VP3）的条带;CVA16-L731 FP和EP的纯度均可达95%;CVA16-L731 VP1兔多抗可与FP及EP的VP1、CVA16-L731 VP2兔多抗可与FP-VP2及EP-VP0发生特异性免疫反应;CVA16-L731FP和EP分别为内部不可被磷钨酸负染的FP致密圆形颗粒和内部可被磷钨酸负染的黑色EP圆型颗粒。小鼠免疫试验结果显示,第1次免疫后各抗原免疫组小鼠血清中和抗体阳性率均为100%;第2次免疫后血清中和抗体滴度和血清特异性Ig G水平均显著升高;第3次免疫后血清中和抗体滴度均无明显变化,但血清特异性Ig G水平均明显升高;第3次免疫后的63 d内,血清中和抗体滴度均无显著变化。各抗原免疫组乳鼠存活率均为100%。结论CVA16-L731 FP和EP均能诱导小鼠持续产生较高水平的血清中和抗体和特异性Ig G抗体,且母传抗体可保护2日龄乳鼠抵抗CVA16-S315的致死性攻击,为CVA16疫苗的研制提供了实验依据。

关键词：柯萨奇病毒A组16型中和抗体垂直保护

CV-A5抗体制备及ELISA抗原检测方法的建立

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中国免疫学杂志 2021年第11期37卷 1346-1351页

作者：张小宇靳卫平王文辉吴杰卢佳孟胜利王泽鋆申硕武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室国家联合疫苗工程技术研究中心武汉430207

目的:制备柯萨奇病毒A组5型(CV-A5)多克隆抗体和单克隆抗体,建立CV-A5抗原定量ELISA检测方法,用于CV-A5疫苗研制中抗原定量及质量控制。方法:纯化后的CV-A5全病毒颗粒作为免疫原,制备兔多克隆抗体并免疫BALB/c小鼠,采用常规细胞融合技... 详细信息

目的:制备柯萨奇病毒A组5型(CV-A5)多克隆抗体和单克隆抗体,建立CV-A5抗原定量ELISA检测方法,用于CV-A5疫苗研制中抗原定量及质量控制。方法:纯化后的CV-A5全病毒颗粒作为免疫原,制备兔多克隆抗体并免疫BALB/c小鼠,采用常规细胞融合技术制备、中和试验和ELISA法筛选获得CV-A5单克隆抗体。建立CV-A5抗原检测方法,确定线性范围,验证其准确度、精密度、稳定性、特异性;检测CV-A5病毒颗粒纯化过程样品抗原含量。结果:制备了高效价的CV-A5兔多克隆抗体及单克隆抗体并建立ELISA抗原检测法,检测范围为15.61000.0 ng/ml;高、中、低3个浓度样品准确度验证回收率为88.5%128.7%;重复性验证CV分别为1.3%、3.2%、1.2%;中间精密度验证CV分别为2.1%、2.2%和3.5%;耐用性验证回收率为97.4%127.6%;包被微孔板37℃放置3 d,样品回收率为101.7%106.9%;特异性验证结果显示抗原检测方法仅识别CV-A5抗原,与CV-A5以外的抗原均无交叉反应。结论:建立的CV-A5 ELISA抗原检测法可用于纯化过程样品的抗原检测,为含CVA5的手足口病(HFMD)多价疫苗的研制提供质量控制方法。

关键词：柯萨奇A组5型多克隆抗体单克隆抗体双抗体夹心ELISA 抗原检测方法