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基于AbPMT启动子的托品烷生物碱代谢工程研究

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基于AbPMT启动子的托品烷生物碱代谢工程研究

作者：刘园园西南大学

学位级别：硕士

颠茄(Atropa belladonna L.)是《中国药典》指定的茄科托品烷生物碱(Tropane alkaloids,TAs)商业药源植物,同时也是开展TAs相关研究的模式植物。托品烷生物碱(Tropane alkaloids,TAs),包括莨菪碱(Hyoscyamine)、山莨菪碱(Anisodamine)和东莨菪碱(Scopolamine)等,常作为抗胆碱药物在临床上被广泛用于止痛解痉、缓解阿尔兹海默症、治疗农药中毒等,其主要依赖于从颠茄等TAs药源植物中提取。野生颠茄中TAs含量极低,极大地制约了莨菪碱及其衍生药物的工业化生产与临床应用。而代谢工程手段是提高药源植物TAs产量,缓解药物资源短缺的有效途径。TAs生物合成途径的解析,为开展代谢工程研究奠定了重要基础。苯乳酸UDP-糖基转移酶(Phenyllactate UDP-glycosyltransferase,UGT1)和海螺碱合成酶(Littorine Synthase,LS)介导的海螺碱生物合成是TAs合成途径重要限速步骤。所在团队前期发现颠茄Ab LS和AbUGT1在托品烷生物碱代谢工程中具有重要应用前景;此外对Ab LS和曼陀罗LS(DsLS)的酶活性研究结果表明,DsLS的催化活性要高于Ab LS;因此,DsLS较于Ab LS是更为理想的TAs代谢工程分子工具。CaMV35S启动子是植物相关研究常用的工程元件,被定义为组成型表达的强启动子,其驱动靶标基因的泛表达也对植物造成了不必要的代谢压力。UGT1、LS等途径基因均在根的中柱鞘细胞中特异性/高水平表达,因此,采用中柱鞘细胞特异性强启动子驱动目标基因来开展TAs代谢工程研究是一种理论上值得尝试的方案。本研究前期基于颠茄转录组分析发现PMT的表达丰度较高,表明AbPMT的启动子(p PMT)在中柱鞘细胞中驱动下游基因的表达能力最强。因此p PMT可以作为候选分子工具(启动子)替代35S启动子开展TAs代谢工程研究。基于文献分析和本研究前期结果,本文分别利用组成型启动子35S和中柱鞘特异性启动子p PMT驱动靶标基因AbUGT1、DsLS,在颠茄发根中开展了托品烷生物碱代谢工程研究。结果如下:1.35S驱动过表达AbUGT1和DsLS均显著提高了颠茄发根中TAs的含量。前人研究表明UGT1和LS是TAs生物合成的限速酶,本研究利用颠茄发根系统,以35S驱动靶标基因AbUGT1和DsLS,开展了TAs代谢工程研究。1)结合g DNA的阳性鉴定以及进一步的q PCR检测结果表明,p1305.1-35S::AbUGT1和p1305.1-35S::DsLS的T-DNA区域被分别成功的整合到了颠茄发根的基因组中,且在相应的转基因发根中AbUGT1和DsLS分别实现了超量表达,可以用于后续的代谢物分析研究。2)对两种转基因发根的生物碱分析结果表明,35S驱动靶标基因AbUGT1和DsLS的过表达均能够显著促进发根中TAs的生物合成,代谢产物分析结果表明35S驱动AbUGT1或DsLS过表达均能够促进颠茄发根中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的含量积累。2.基于颠茄转录组分析发现,PMT在颠茄侧根中表达丰度最高在代谢工程中的研究中,35S启动子是常用的组成型启动子,其能够驱动目的基因在植物体的各个组织中持续而高效的表达;前人研究发现,靶标基因的泛表达可能会过度消耗细胞内的物质和能量,对植物造成不必要的代谢压力。本研究基于颠茄转录组对颠茄13个TAs代谢途径基因的表达情况进行了分析,研究发现UGT1、LS这两个莨菪碱生物合成限速酶基因的在侧根(TAs生物合成部位)的表达丰度较低,而PMT的表达丰度最高,表明AbPMT的启动子(p PMT)在中柱鞘细胞中驱动下游基因的表达能力最强。以上分析结果表明,p PMT可以作为理想工程元件(启动子)替代35S启动子驱动AbUGT1或DsLS,来开展TAs代谢工程研究。3.p PMT启动子驱动过表达AbUGT1和DsLS较35S对颠茄发根中TAs促进作用更为显著。前人研究表明,在天然产物代谢工程研究中,通过优化靶标基因的表达定位能够高效促进目标产物的生物合成。本研究利用根中柱鞘细胞特异性启动子在颠茄发根中分别驱动了AbUGT1和DsLS的过表达,研究内容及结果如下:1)基于g DNA的PCR检测结果以及q PCR检测结果表明,p PMT能够高效驱动下游靶标基因在转基因发根中的超量表达。2)对两种转基因发根的生物碱分析结果表明,p PMT驱动靶标基因AbUGT1和DsLS的过表达均能够显著促进发根中TAs的生物合成。3)进一步综合对p PMT和35S启动子驱动过表达AbUGT1或DsLS转基因发根中生物碱的纵向比较,结果表明p PMT对TAs的生物合成的促进作用更为显著;上述研究结果表明,根中柱鞘细胞特异性启动子p PMT在TAs代谢工程中具有重要的应用价值。综上所述,本研究首先利用35S

关键词：颠茄 PMT 启动子托品烷生物碱代谢工程

面向复杂移动前景及大视差挑战的图像拼接研究

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面向复杂移动前景及大视差挑战的图像拼接研究

作者：陈园园天津理工大学

学位级别：硕士

图像拼接作为计算机视觉中的一项重要研究,旨在将具有重叠区域的一组图像融合成大视场的全景图。虽然图像拼接研究取得了不错的进展,但是由于复杂移动前景和大视差问题,对于获得更加自然的全景图仍然充满挑战。本文基于主流拼接方案,从... 详细信息

图像拼接作为计算机视觉中的一项重要研究,旨在将具有重叠区域的一组图像融合成大视场的全景图。虽然图像拼接研究取得了不错的进展,但是由于复杂移动前景和大视差问题,对于获得更加自然的全景图仍然充满挑战。本文基于主流拼接方案,从实用性角度出发,提出了面向复杂移动前景及大视差挑战的图像拼接研究。具体如下:针对移动前景过于相似导致其对应物体间难以匹配,同时大视差现象容易造成视差伪影和结构失真的问题,提出了一种基于多对多前景匹配和稳固结构保持的图像拼接算法。具体来讲,首先通过提取复杂移动前景的深度特征,构建了一种基于相似性度量的多对多匹配机制,用以解决复杂移动前景匹配难的问题。其次,设置了以对齐项、线保持项和失真控制项为主的能量约束项,通过确保重叠区域内的高质量对齐和加强非重叠区域的结构保真来减少视差伪影和失真。大量的实验表明,与主流图像拼接方法相比,所提方法能够提供更自然的拼接结果,同时在峰值信噪比和结构相似性指标上也取得了更好的性能。针对输入图像预对齐阶段,复杂移动前景极易干扰特征检测和配准,及大视差容易造成全局线性结构拉伸和扭曲的问题,提出了一种基于特征增广选择和单应性模型优化的图像拼接算法。具体地,首先采用推土机距离改进SIFT相似性度量并设置加权因子实现基于递进式的特征增广选择策略,从而避免复杂移动前景引起的特征误匹配问题。其次,设计了一种全局线生成策略,对单应性模型使用由局部线、全局线、相邻网格三方面联合约束的综合优化方案,有效改进了线性结构拉伸和扭曲的问题。通过对比研究和消融实验证明,所提算法在特征增广和模型优化上优于现有主流方法,有效提高了拼接的准确性,与传统方法相比在均方根误差指标上提高了约37%。

关键词：图像拼接复杂移动前景大视差前景匹配特征增广

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老旧居住小区功能提升的影响因素及其评价

老旧居住小区功能提升的影响因素及其评价

作者：赵园园东北财经大学

学位级别：硕士

随着我国房屋市场发展,住房已经从增量转向存量市场,存量市场里有很大一部分是老旧居住小区,建成久远,较破旧,与周边近期建筑形成明显新旧对比,国家也发布老旧居住小区改造相关政策,2019年后,老旧居住小区的更新提升已成为城市规划的重... 详细信息

随着我国房屋市场发展,住房已经从增量转向存量市场,存量市场里有很大一部分是老旧居住小区,建成久远,较破旧,与周边近期建筑形成明显新旧对比,国家也发布老旧居住小区改造相关政策,2019年后,老旧居住小区的更新提升已成为城市规划的重点工作。各地也陆续开展老旧居住小区改造工作。同时,老旧居住小区改造内容也广泛出现在学术研究领域。通过查找收集资料文献,并对文献的内容研究梳理,发现现有资料老旧居住小区研究内容主要集中在改造后评价、绩效研究、改造模式优化等方面,对老旧居住小区改造提升的影响因素研究较少,影响因素研究对老旧居住小区改造提升的难度有一定影响,影响分析决策,基于此,本文就老旧居住小区功能提升的影响因素及其评价展开研究,影响因素主要侧重于功能提升前期的决策阶段,研究内容如下。首先,本文查阅国内外城市更新、老旧居住小区相关文献资料,国内外城市更新历程主要是三个阶段,国外更新进程总体来说第一阶段拆除旧城区,取而代之高楼大厦,第二阶段小规模分期改造,第三阶段城市综合更新、可持续再生,是对城市进行经济、社会、文化、历史、环境、资源等多维度综合更新;国内更新进程第一阶段快速解决住宅短缺问题,保证人民有房住,第二阶段改善居民条件,第三阶段强调城市更新不仅城市物质结构更新,是环境、社会、文化等综合更新,要以人为本,重视人居环境的改善,注重城市的可持续发展。在此基础上归纳分析国内老旧居住小区的研究热点及不足之处,研究内容主要集中在改造后评价、绩效研究、改造模式优化等方面,对老旧居住小区改造提升的影响因素研究较少,进而确定本论文研究视角和研究内容,研究内容是老旧居住小区功能提升的影响因素及其评价,研究视角集中在老旧小区功能提升实施前的影响因素分析。然后论述相关理论及理论基础,明确老旧小区概念,界定研究范围,侧重于老旧小区功能提升实施前的影响因素分析。其次,在研读文献资料的基础上,结合实地走访,专家二次修正,确定功能提升的影响因素共19项,并根据因素性质将其划分为四大类,分别是居民相关方面、经济和社会的发展方面、小区自身条件、以人为本和可持续发展方面。居民相关方面有居民改造意愿、居民对改造的认知程度、居民整体的经济状况、社区宣传引导;小区自身条件有建筑物现状、基础设施、小区环境、区位条件、资料档案、产权关系;经济和社会的发展方面有资金需求量、融资及资金回报情况、改造相关文件政策,法律支持、相关部门权责划分及各部门协调难度、改造事项选择;以人为本和可持续发展方面有环境及绿化水平、基础设施节能环保、日常节能环保设施情况、废物管理情况。采用模糊层次分析法构建老旧居住小区功能提升影响因素的模型。然后用模糊综合评价法构建老旧小区功能提升的评价模型。最后选取抚顺市顺大小区进行案例研究,采用调查问卷方法向小区居民及工作人员发放“老旧居住小区实施改造难度的调查问卷”并回收数据,分别从居民相关方面、小区自身条件、经济和社会的发展方面、以人为本和可持续发展方面统计各因素目前状态对功能提升的难度大小,进而分析此小区进行功能提升的总体难易程度,计算得出顺大小区功能提升的总体难度一般,仍有一定难度。验证模型的可靠性与实用性,并根据评价结果提出相应的对策及建议。给从事老旧小区工作的决策者提供参考。老旧小区功能提升的重点主要集中在社会和经济发展方面,其他方面的影响相对较小。在社会和经济发展方面,资金需求量、融资及资金回报情况、改造相关文件政策,法律支持、相关部门权责划分及各部门协调难度又是关注度比较高的。主要原因资金量不足,融资困难,配套政策不完善,各部门协调困难,沟通不畅。所以需要优先解决资金融资、法规政策和部门协调方面问题,降低老旧小区功能提升的难度,推进小区的功能提升。

关键词：老旧居住小区功能提升影响因素

演进韧性视角下城市社区治理转型:从结构到过程的建设路径

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南京社会科学 2024年第2期 65-73,85页

作者：任园园张勤南京航空航天大学马克思主义学院江苏连云港222000 南京医科大学康达学院南京航空航天大学人文与社会科学学院南京210019

城市社区韧性治理是国家治理现代化的重要组成部分。伴随着国家治理体系和治理能力现代化持续推进,加之新冠肺炎疫情等重大公共危机事件的现实冲击,韧性治理面临着韧性建设与应对公共安全危机匹配不足的阶段性新问题。以强“社会—生态... 详细信息

城市社区韧性治理是国家治理现代化的重要组成部分。伴随着国家治理体系和治理能力现代化持续推进,加之新冠肺炎疫情等重大公共危机事件的现实冲击,韧性治理面临着韧性建设与应对公共安全危机匹配不足的阶段性新问题。以强“社会—生态”记忆、强“自我组织”能力和强“学习型”结构为特征的演进韧性能够为克服问题提供重要理论支撑。良好的演进韧性可作用于复杂动态的社会生态系统,能够在利用、保存、释放和重组四个不同阶段的循环中实现转化均衡,建立起适应性更强的韧性系统。本文基于维护演进韧性可持续性的原则,结合当前韧性治理实践,从上述四个阶段分析阐释了韧性治理从结构性建设向过程性建设的转型路径,具体分析了维护韧性演进可持续的机制和做法,为推进社区安全系统在不同的韧性发展阶段克服错位问题并实现韧性演进提供参考思路,以期丰富当前的韧性治理理论。

关键词：城市社区韧性治理重大公共危机演进韧性

丁香不同种和品种间花香成分比较和转录组分析

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丁香不同种和品种间花香成分比较和转录组分析

作者：朱园园山东农业大学

学位级别：硕士

花香是观赏植物的品质指标之一,可吸引授粉者和种子传播者,在香料香精工业中也具重要作用。丁香为温带起源的木本芳香植物,观赏价值和经济价值都较高,花香浓郁,花型优美,花色雅致,树体抗旱、抗寒、耐盐碱,叶片和花均有药用价值和保健功... 详细信息

花香是观赏植物的品质指标之一,可吸引授粉者和种子传播者,在香料香精工业中也具重要作用。丁香为温带起源的木本芳香植物,观赏价值和经济价值都较高,花香浓郁,花型优美,花色雅致,树体抗旱、抗寒、耐盐碱,叶片和花均有药用价值和保健功效,还可以加工为香水和茶饮,是美化环境的理想树种,同时也是山东省重要观赏树种,市场需求空间大。香气是丁香的关键属性,近年来已是丁香属植物研究领域内的热点,对丁香的观赏价值和实用价值有着重要的贡献;研究丁香花香的化学组分,在此基础上进一步研究花香形成的调控机制,可为丁香功能的深度研发提供科学支撑。但是,有关丁香花香成分测定和转录组联合分析的研究较少,与花香形成相关的基因发掘研究工作进展较缓。本研究选取了丁香属内两个代表性的种--香气淡雅清香的紫丁香(Syringa oblata)和香气浓郁强烈的欧丁香(Syringa vulgaris)作为研究对象;以传统紫丁香品种‘AZDX2018003’(Z03)、自育紫丁香新品种‘紫魁’(ZK)、传统欧丁香品种‘瓷蓝’(CL)、自育欧丁香新品种‘丽妃’(LF)共计4个品种为试材,利用顶空-固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱法(GC-MS)联用技术对花瓣样品进行挥发性成分的收集和相对定量;同时利用转录组测序对花瓣样品进行分析,比较不同种和品种间的差异表达基因和富集情况;通过挥发物质组分和转录组联合分析,筛选出若干与丁香花香特征紧密相关的基因如萜烯合酶基因(TPS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(HMGS),并利用实时定量PCR在不同品种内对目标基因的表达模式进行了验证;进一步将目标丁香TPS基因通过瞬时表达的方式在烟草中进行了初步的验证。预分析发现四个丁香品种同时比较,重复性较差,香气成分差异较大,分析困难;因此本研究重点进行了两两比较,一组为紫丁香的传统品种和自育品种之间的比较(Z03 vs ZK;属同种内的品种间比较),另一组为紫丁香和欧丁香自育品种间比较(ZK vs LF;属种间比较),结果如下:1、通过比较自育紫丁香ZK和自育欧丁香LF两个品种,分析花瓣的芳香成分及其相对含量,共鉴定出43种挥发性成分,其中,萜类挥发物是构成两个品种花瓣内香气最丰富的挥发性物质,ZK中烯萜类物质占76.9%,LF中烯萜类物质占60%。ZK和LF两个品种共有物质为10种,其中9种物质在ZK中含量更高,包括7种烯萜类物质、1种醇类物质和1种烷类物质;1种物质在LF中含量更高,属酯类物质;3种挥发性物质为ZK特有,30种挥发性物质则为LF特有。2、对ZK和LF的花瓣样品进行的转录组测序共获得6411个差异表达基因;与ZK相比,LF中有4327个基因表达上调,2084个基因表达下调;其中,泛醌和其他萜醌类生物合成基因显著富集。将挥发性物质和转录组数据进行了相关性分析,结果表明TPS、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(GGPPS)和HMGS可能是导致两个丁香品种花香成分差异的关键基因,在丁香花香成分的次生代谢通路中发挥了重要的作用。3、通过比较传统紫丁香Z03和自育紫丁香ZK两个品种,分析花瓣的芳香成分及其相对含量,共鉴定出30种挥发性成分,烯萜类物质是含量最丰富的挥发性物质;Z03中烯萜类物质占66.7%,ZK中烯萜类物质占84.6%。Z03和ZK两个品种共有物质有3种,其中,2种烯萜类物质在ZK中含量更高;1种酯类物质在ZK种含量更高。Z03特有挥发性代谢物有12种,ZK有10种。4、对Z03和ZK的花瓣样品进行了转录组测序,获得5113个差异表达基因;与Z03相比,ZK中有2118个基因表达上调,2995个基因表达下调。经挥发性代谢组和转录组联合分析,进一步发现TPS、法尼基焦磷酸合成酶基因(FPPS)是导致二者间花香成分差异的主要基因。5、使用实时定量PCR对上述研究中筛选出的目标基因如TPS和HMGS在不同品种内进行了表达模式的验证;随后将TPS基因瞬时表达至烟草叶片,与空载对比分析挥发性物质的改变,对基因功能的初步验证进行了尝试,以期在分子层面上为丁香香气形成的机理研究提供参考。本研究旨在为丁香香气的开发利用提供理论基础和试验依据,加深对丁香香气调控机理的认识,后续有助于通过代谢工程改良丁香的香气品质。

关键词：紫丁香欧丁香香气挥发性物质转录组

基于微脉冲激光雷达的云参数和云相态反演方法研究

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基于微脉冲激光雷达的云参数和云相态反演方法研究

作者：孟园园南京信息工程大学

学位级别：硕士

目的论视阈下《Общение с трудными детъми》（二）中长难句汉译实践报告

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目的论视阈下《Общение с трудными детъм...

作者：杨园园哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

本篇翻译实践报告的原文文本材料节选自安东·谢苗诺维奇·马卡连柯《Общение с трудными детъми》一书的第一章和第二章,前两章讲述了家庭教育对孩子的影响。原文文本的语体结构较为复杂,具有科学语体等特征,文... 详细信息

本篇翻译实践报告的原文文本材料节选自安东·谢苗诺维奇·马卡连柯《Общение с трудными детъми》一书的第一章和第二章,前两章讲述了家庭教育对孩子的影响。原文文本的语体结构较为复杂,具有科学语体等特征,文中包含大量长难句,句中多种语法成分叠加,是翻译过程中的重难点。本报告以翻译原文文本中的长难句为例,借助目的论及相关原则,分析目的论在翻译长难句中的应用,具体分析翻译过程中所用到的翻译方法,并从词汇和句子层面归纳总结翻译策略和翻译技巧。目的论翻译理论应用到翻译过程中能使汉译本更接近中国读者语言习惯,减少原文中存在的文化差异。在翻译的过程中,以汉语语言的表达习惯和文化价值为主,能使汉译本的语言形式更合理通顺。本篇实践报告共分为四个部分。第一章是翻译任务描述,主要有翻译的目的及意义和翻译实践过程描述。第二章为相关理论概述,具体有目的论的提出,目的论的形成和发展,目的论的翻译原则和分析长难句。第三章翻译案例分析,为本报告的核心部分,阐述了目的论及其相关原则在翻译原文文本过程中的应用。第四章为翻译实践总结,围绕翻译实践收获和翻译过程中发现的不足两个方面进行反思和总结。本篇报告借助具体翻译实践归纳信息型文本俄译汉中遇到的问题,并在此基础上总结出此类文本的翻译方法,为今后的翻译工作总结经验,进一步提高自身翻译水平,同时希望能够为相关领域的翻译实践提供参照。

关键词：翻译目的论长难句翻译俄译汉

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并购项目中对赌安排的绩效影响

并购项目中对赌安排的绩效影响

作者：郑园园西南财经大学

学位级别：硕士

伴随着中国经济全球化进程的不断推进,目前中国资本市场中的企业间并购重组呈现出一片欣欣向荣的景象。在中国,针对企业并购重组过程中存在的信息不对称和保护投资者利益等问题,企业运用对赌协议进行估值调整的现象越来越普遍。当买卖... 详细信息

伴随着中国经济全球化进程的不断推进,目前中国资本市场中的企业间并购重组呈现出一片欣欣向荣的景象。在中国,针对企业并购重组过程中存在的信息不对称和保护投资者利益等问题,企业运用对赌协议进行估值调整的现象越来越普遍。当买卖各方就标的物的价值与价格相互博弈时,对赌协议中所规定的具体条款必然是一个值得考量的问题。本文拟以上市公司在并购项目过程中签署对赌协议对上市公司并购绩效的影响作用为切入点,以不同的对赌条款安排具体展开,探讨不同的对赌条件对于短期并购绩效和长期并购绩效的不同作用。尽管目前国内外的相关研究已经关注到了对赌协议对于企业并购绩效的影响,但是针对对赌具体条款安排出发,探讨各个条款安排分别对于并购方企业短期并购绩效和长期并购绩效的作用效果差异的研究还不足。本文的特色在于从信息不对称理论、激励理论和委托代理理论出发,将企业并购绩效的关键影响要素聚焦于对赌协议及其具体条款安排。以此角度分析并购对上市公司长期和短期业绩的影响,完善企业并购的研究成果,为对赌协议在并购交易的中发挥其最大效用做出贡献。本文以2014-2019年在沪、深两市A股主板、中小板与创业板的上市公司样本为研究对象,从两个方面展开研究:(1)考察对赌协议对上市公司并购绩效的影响,探讨对赌协议对上市公司并购后短期绩效和长期绩效是否起保护作用。(2)在以上研究基础上,从对赌协议的具体条款安排入手,包括业绩承诺水平、补偿方式、补偿方向以及对赌期限等方面,进一步考察对赌合同安排对上市公司并购中的短期和长期业绩的影响。通过研究,得到以下结论:(1)在并购项目中引入对赌协议,会短期内显著提高并购绩效,而对长期并购绩效的是起负面作用的。(2)对赌协议中高业绩承诺水平条款在短期内对并购绩效起负面作用,而对长期绩效影响不显著。(3)根据对赌协议中补偿方法的研究,现金补偿在短期内会降低并购绩效,股份补偿在短期内会有利于并购绩效的提升。但从长期来看,两种补偿方法对并购绩效都没有重大影响。(4)根据对赌协议中补偿方向条款的研究,补偿方向对并购绩效的影响不显著。(5)根据对赌协议中对赌期限条款的研究,短期对赌和长期对赌对并购绩效的影响均不显著。就本文的研究,我们可以得到一些启示:在并购项目中,签订对赌协议可以短期内发挥一定积极作用,但不利于长期并购绩效。这很有可能存在为了完成对赌而做高短期业绩的现象,如此做法必定会压低后期绩效,不利于企业长期发展。不同的条款组合对上市公司短期和长期并购绩效影响不同,许多条款影响短期绩效,但对长期业绩几乎没有影响。所以上市公司对于对赌协议的作用要保持理性看待,并设置合理的条款。监管层应积极参与改进对赌协议条款设置,一方面要确立对承诺方更具有约束力的业绩对赌条款,另一方面,加大对虚高业绩承诺的惩罚力度。

关键词：对赌协议并购绩效信息不对称业绩承诺

Lnc＿000048靶向PKR强化JAK1/STAT1通路介导的巨噬细胞向M1型极化

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Lnc＿000048靶向PKR强化JAK1/STAT1通路介导的巨噬细胞向M1型极化

作者：丁园园青岛大学

学位级别：硕士

目的:动脉粥样硬化可导致大动脉粥样硬化型(Large Artery Atherosclerosis,LAA)脑梗死。动脉粥样硬化病因复杂,确切的分子机制仍不清楚。巨噬细胞是动脉粥样硬化的核心免疫细胞,其数量和表型影响疾病的进展和消退。长链非编码RNA(Long n... 详细信息

目的:动脉粥样硬化可导致大动脉粥样硬化型(Large Artery Atherosclerosis,LAA)脑梗死。动脉粥样硬化病因复杂,确切的分子机制仍不清楚。巨噬细胞是动脉粥样硬化的核心免疫细胞,其数量和表型影响疾病的进展和消退。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lnc RNA)可以通过多种机制调节巨噬细胞表型。双链RNA依赖的蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)是一种免疫相关的RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)。既往研究发现lnc RNA与PKR结合形成复合物,可进一步激活下游通路。我们前期研究在患者中发现lnc＿000048与LAA进展及不良预后相关,但其分子调控机制尚不清楚。因此,我们的研究旨在探索lnc＿000048在巨噬细胞中的功能,验证其是否通过靶向PKR强化JAK1/STAT1通路介导的巨噬细胞极化。方法:采用体外培养人单核细胞(Tohoku Hospital Pediatrics-1,THP-1),给予佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导活化24小时后继续用不含PMA培养基培养24小时成为静息状态的巨噬细胞(M0),若进一步用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)/干扰素γ(Interferon-gamma,IFN-γ)刺激48小时则构建经典激活巨噬细胞(M1),并通过实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,RT-q PCR)验证标志物基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、CD38、CD80)m RNA的表达和流式细胞术验证表型蛋白(CD11b、CD38、CD80)。通过RT-q PCR检测不同巨噬细胞模型中lnc＿000048的差异表达。通过慢病毒转染构建Sh-lnc＿000048,Sh-NC,Oe-lnc＿000048,Oe-NC转染后的THP-1稳定株,在此基础上构建巨噬细胞极化模型并用流式细胞术、蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)及RT-q PCR验证lnc＿000048对巨噬细胞极化的影响。通过cat RAPID网站预测及RNA-pull down和质谱结合的方法来鉴定并筛选出lnc＿000048的结合蛋白PKR(别名eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2,EIF2AK2),并使用cat RAPID和RPIseq网站预测lnc＿000048与PKR的结合能力。用lnc Locator在线数据库和原位杂交及免疫荧光对lnc＿000048和PKR进行亚细胞定位。构建M1型巨噬细胞Sh-lnc＿000048-M1组和Sh-NC-M1组,Oe-lnc＿000048-M1组和Oe-NC-M1组,空白对照和JAK抑制剂组,DMSO对照和PKR抑制剂组,PKR抑制剂组+Oelnc＿000048组和PKR抑制剂+Oe-NC组,分别通过蛋白印迹检测STAT1、p-STAT1、PKR、p-PKR蛋白表达水平,Image J分析蛋白相对表达量;流式细胞术分析CD38标记的M1型巨噬细胞含量;RT-q PCR检测M1型巨噬细胞相关极化标志物基因m RNA的表达差异。结果:1.用PMA和LPS/IFN-γ成功构建M0和M1型巨噬细胞模型,lnc＿000048在M1型巨噬细胞中表达量比在M0型高(P0.05),说明抑制JAK活性不影响总STAT1及磷酸化表达,说明lnc＿000048可强化激活JAK1/STAT1通路介导巨噬细胞向M1型极化。4.通过lnc Locator在线数据库

关键词： LncRNA PKR 巨噬细胞极化 JAK1/STAT1信号通路