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Myh11基因敲除对雄性小鼠生殖功能影响的研究

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Myh11基因敲除对雄性小鼠生殖功能影响的研究

作者：王万伦内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的肌球蛋白家族在生殖系统中发挥重要的作用,有研究发现肌球蛋白重链11(myosin heavy chain 11,Myh11)表达降低可能会导致雄性不育。通过基因编辑技术获得Myh11睾丸条件性敲除(Conditional knockout,CKO)以及全身性敲除(knockout,KO)... 详细信息

目的肌球蛋白家族在生殖系统中发挥重要的作用,有研究发现肌球蛋白重链11(myosin heavy chain 11,Myh11)表达降低可能会导致雄性不育。通过基因编辑技术获得Myh11睾丸条件性敲除(Conditional knockout,CKO)以及全身性敲除(knockout,KO)小鼠,验证Myh11缺乏是否会导致雄性不育。方法经评估MYH11基因3号外显子是敲除效率最高且脱靶概率最低的作用位点,选择为条件性敲除区域(CKO区域),构建靶向同源重组载体,将靶向同源重组载体、g RNA和Cas9蛋白导入小鼠中;靶向同源重组载体中5’-lox P位点插入区域位于2号内含子内,3’-lox P位点插入区域位于3号内含子内,借助CRISPR/Cas-9基因编辑技术,靶向敲除Myh11基因的第3号外显子。同时利用Cre-lox P重组系统,采用受精卵偏好同源重组修复等途径,提高同源重组效率,实现睾丸条件性基因敲除(CKO),培育得到flox小鼠(Myh11),将flox小鼠和睾丸组织特异性表达Vasa-Cre酶的小鼠进行交配得到F1代flox杂合子小鼠(Myh11);进一步交配得到纯合子(Myh11)。通过大量交配实验检测CKO杂合以及纯合鼠的生育能力,观察CKO杂合以及纯合鼠睾丸形态学改变,对CKO杂合以及纯合鼠精子各项参数进行分析,包括精子畸形率、侧摆幅值、摆动性、鞭打频率、线性度、移动角度以及前进性等,同时通过CRISPR/Cas-9基因编辑技术针对MYH11基因的3号外显子特定位点进行敲除获得Myh11基因全身性敲除小鼠(KO)模型,统计KO鼠与对照鼠体重、睾丸重量、睾丸/体重比、生育能力以及生后一天死亡率;精子分析检测基因敲除鼠精子的各项参数的变化;通过睾丸切片HE染色、免疫荧光以及PAS染色观察Myh11基因敲除小鼠生精管腔的结构变化,精子发生是否阻滞以及阻滞阶段,随后取不同时期的胚胎(E7.5,E14.5)进行基因型检测是否形成KO纯合(Myh11)胚胎。检测Myh11在野生型小鼠全身14个组织中的表达情况,通过q-PCR方法检测Myh11表达减少后相关通路以及同源基因的变化。结果我们通过基因编辑技术成功得到了F0 CKO杂合鼠以及F0 KO杂合(Myh11)鼠后,根据交配策略大量繁殖后经鉴定只得到4只CKO杂合鼠,1只CKO纯合鼠,并未得到更多的CKO杂合、纯合后代,而KO鼠经过大量繁殖以及鉴定后只得到KO杂合后代,无法得到KO纯合后代,交配实验显示CKO杂合(9±1.65只)、CKO纯合(8.25±2.49只)以及KO杂合鼠(6.90±2.33只)与野生型(8.58±2.27只)鼠相比生育能力未出现明显下降;表型方面,CKO杂合鼠、CKO纯合鼠以及KO杂合鼠睾丸形态及重量没有明显异常,精子分析显示,CKO杂合鼠、CKO纯合鼠以及KO杂合鼠精子畸形率、侧摆幅值、摆动性、鞭打频率、线性度、移动角度以及前进性等参数相较于野生型未见明显差异;HE染色显示KO杂合鼠的睾丸管腔相较于野生鼠其结构不规则,但没有出现精子发生阻滞;我们对KO杂合雌鼠进行解剖取胚胎进行鉴定,发现在7.5天以及14.5天的胚胎中我们鉴定出纯合子KO胚胎,且14.5天的纯合KO胚胎体积明显小于野生型胚胎,HE染色显示14.5天KO纯合子胚胎明显发育停滞。Myh11在野生型小鼠全身14个组织中都有不同程度的表达,在泌尿生殖系统的表达量高;免疫组化显示在野生鼠睾丸中,Myh11的表达贯穿于睾丸整个发育周期。同时通过q-PCR检测我们发现在KO杂合鼠的睾丸中,同源基因Myh5a表达水平增高。结论Myh11在泌尿生殖系统中表达量高,Myh11的表达贯穿于小鼠睾丸整个发育周期,CKO纯合以及杂合鼠的表型、生育能力、精子各项参数不会出现明显改变;KO杂合鼠的睾丸管腔形态出现不规则,但是由于同源基因Myh5a的代偿作用,KO杂合鼠不会明显改变小鼠的生育能力;而Myh11一旦完全缺失则会导致小鼠在胚胎阶段就出现发育阻滞,无法得到KO纯合后代。

关键词：生殖系统 Myh11 基因编辑技术雄性不育

推行定收定贷实施动态管理——石首市工商银行盘活贷款存量的几点做法

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武汉金融 1990年第1期 53-54页

作者：刘崇文夏朝阳王万伦湖北省石首市工商银行

八九年以来,石首市工商银行在宏观紧缩和资金短缺的情况下,推行定收定贷的管理办法,以收核贷,以贷促收,多收优贷,少收紧贷,跟踪监测,动态管理,把贷款的投放建立在按期归流的基础上,使收和放取得动态平衡。通过定收定贷,一方面督促企业... 详细信息

八九年以来,石首市工商银行在宏观紧缩和资金短缺的情况下,推行定收定贷的管理办法,以收核贷,以贷促收,多收优贷,少收紧贷,跟踪监测,动态管理,把贷款的投放建立在按期归流的基础上,使收和放取得动态平衡。通过定收定贷,一方面督促企业扩大销售,促进货款回笼,防止资金体外循环,避免资金沉淀;另一方面帮助企业处理消化包袱,启动盘活存量,缓解了资金供求矛盾,促进了地方经济的稳定发展。石首市工商银行在宏观紧缩下积极盘活信贷资金存量,主要采取了以下措施: 一、全年亮底。

关键词：工商银行动态管理资金供求矛盾银行资金信贷结构调整资金体外循环资金短缺资金沉淀企业经济宏观紧缩

小鼠初级精母细胞GC-2中TUBB4B的表达及其对NF-κB和MAPK信号通路的调控

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南方医科大学学报 2023年第6期43卷 1002-1009页

作者：刘桐佳王万伦张婷刘爽边艳超张传领肖瑞内蒙古医科大学内蒙古自治区分子病理学重点实验室内蒙古呼和浩特010059 内蒙古医科大学药学院内蒙古呼和浩特010059

目的探究微管蛋白(TUBB4B)与胞浆羧肽酶(CCP1)在小鼠初级精母细胞(GC-2)中的互相作用关系,以及TUBB4B在调控GC-2发育中的作用。方法使用慢病毒感染GC-2细胞分别构建TUBB4B基因敲减组(TUBB4B-KD组)和阴性对照组(NCKD组);TUBB4B基因过表达... 详细信息

目的探究微管蛋白(TUBB4B)与胞浆羧肽酶(CCP1)在小鼠初级精母细胞(GC-2)中的互相作用关系,以及TUBB4B在调控GC-2发育中的作用。方法使用慢病毒感染GC-2细胞分别构建TUBB4B基因敲减组(TUBB4B-KD组)和阴性对照组(NCKD组);TUBB4B基因过表达组(TUBB4B-OE组)与阴性对照组(NC-OE组),利用嘌呤霉素筛选稳定细胞株。采用RT-qPCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测细胞模型是否构建成功,并进一步探究在GC-2细胞中TUBB4B与CCP1二者之间相互调控的表达关系。CCK8及流式细胞术检测TUBB4B沉默和过表达后对GC-2细胞增殖及周期的影响;Western blot及细胞免疫荧光实验找出TUBB4B沉默和过表达后发生表达改变的信号通路因子,并在细胞水平上进行标记验证。结果GC-2中与NC-KD(NC-OE)组相比,TUBB4B沉默和过表达后,CCP1在mRNA和蛋白水平上的表达均发生一致的性改变(P<0.05);同样CCP1敲减和恢复表达后与NC组相比,TUBB4B的表达也随之发生一致的性改变(P<0.05)。CCK8和流式细胞术实验发现TUBB4B敲减和过表达对GC-2的增殖速率和细胞的周期无明显改变。Western blot和细胞免疫荧光实验显示TUBB4B敲减和过表达后,细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路关键蛋白:p65,p-p65与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键蛋白:ErK1/2,p-ErK1/2会发生相应的明显改变(P<0.05);而CCP1敲减后会明显影响PolyE表达(P<0.05)。结论在GC-2细胞中TUBB4B与CCP1表达相互调控为正向作用,且CCP1对TUBB4B具有去谷氨酰化修饰作用,TUBB4B参与初级精母细胞中NF-κB和MAPK信号通路的调控。

关键词：雄性不育胞浆羧肽酶微管蛋白初级精母细胞 NF-κB通路 MAPK通路

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聚合效应对四溴荧光素水溶液荧光寿命的影响

中山大学学报(自然科学版)(中英文) 1983年第1期 31-34页

作者：林位珠张永良王万伦方心东中山大学物理学系

用超快Kerr 光闸技术测量了四溴焚光素水溶液在各种浓度和温度下的焚光寿命.实验结果表明在1×10-3M 至1×10-2M 的浓度范围内,激发态染料分子和染料分子二聚物的互作用可能是造成这种溶液焚光寿命随浓度增加而减小的主要原因.

关键词：荧光寿命荧光素溶液浓度二聚物聚合物聚合效应

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一种实用的光学多道分析器

应用激光 1985年第1期8卷 45-48页

作者：陈健李伟良王万伦林位珠李文冲中山大学物理系激光光谱学研究室

本文介绍一种用电视摄像机、微型计算机以及一些辅助设备组成的简易光学多道分析器。作为一种测量瞬态或稳态空间光强分布的仪器,它可用于瞬态激光光学和光谱学测量,也可用于常规光谱测量。

关键词：摄像机场扫描光学微型计算机个人电脑电子数字计算机靶面摄像管电子束管光强分布行扫描多道分析器分析仪器

不同阻滞阶段非梗阻性无精子症的生物信息学分析

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国际生殖健康／计划生育杂志 2022年第4期41卷 270-274,297页

作者：王万伦刘桐佳张婷李硕边艳超肖瑞内蒙古医科大学内蒙古自治区分子病理学重点实验室呼和浩特010059

目的:利用生物信息学筛选不同阻滞阶段非梗阻性无精子症(NOA)相关的调控因子及其调控途径,为后续的功能研究提供依据。方法:从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中获得GSE45885的基因表达谱矩阵,筛选其中的正常样本以及不同阻滞阶段NO... 详细信息

目的:利用生物信息学筛选不同阻滞阶段非梗阻性无精子症(NOA)相关的调控因子及其调控途径,为后续的功能研究提供依据。方法:从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中获得GSE45885的基因表达谱矩阵,筛选其中的正常样本以及不同阻滞阶段NOA样本,包括4例正常生精样本和20例NOA患者样本,20例NOA患者中有2例患者处于减数分裂前期阻滞阶段(PRE),7例处于减数分裂期阻滞阶段(MEI),11例处于减数分裂后期阻滞阶段(POST)。将正常生精样本设置为对照组(CON),使用GEO2R在线工具鉴定正常生精样本与不同阻滞阶段NOA样本之间的差异基因,对GEO芯片中不同阻滞阶段的NOA数据整合归一化并进行矫正后取交集。对差异表达的基因以及其靶基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,获取关键通路;基于在线工具(STRING)构建蛋白质相互作用(PPI)网络图。然后利用Cytoscape中的Cyto Hubba插件对枢纽基因进行筛选。结果:在PRE中筛选出463个上调基因,12个下调基因;在MEI和POST中分别发现2个和3个下调基因,无上调基因。PRE中上调基因通过一些重要途径,如精子发生、精子细胞发育、精子的运动、纤毛运动和微管形成等功能来调控生精过程。在上述的3个阻滞阶段NOA中筛选出2个共同差异基因,均为微小RNA(mi RNA),2个mi RNA有58个共同靶基因。利用在线生物信息学工具STRING成功构建PRE中上调基因的PPI网络图,并使用Cytoscape筛选出网络中前10个枢纽基因,包括DNAI1、DNAI2、PGK2、ROPN1L、ARMC4、DRC1、DNAAF3、CABYR、ZMYND10和CCDC65。结论:识别枢纽基因和共同差异基因及其通路为后续研究NOA的发生机制提供了有价值的参考,DRC1、ARMC4、MIR15A和MIR509-3可作为后续NOA发病机制研究的潜在靶点。

关键词：无精子症基因表达谱非梗阻性无精子症靶基因功能富集分析

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超短行波放大自发辐射的研究

中国激光 1987年第7期 393-398页

作者：李文冲宁长龙黄作柱陈健王万伦中山大学物理系

用泵浦能量具有梯度分布的横向同步泵浦方案,产生超短行波自发辐射光脉冲。以N2激光为泵浦源,获得约50ps的染料光脉冲输出,以锁模Nd:YAG倍频光作泵浦源,获得8～15ps光脉冲。用条纹照相机和光学多道分析器测量了脉冲波形和光谱。计算机... 详细信息

用泵浦能量具有梯度分布的横向同步泵浦方案,产生超短行波自发辐射光脉冲。以N2激光为泵浦源,获得约50ps的染料光脉冲输出,以锁模Nd:YAG倍频光作泵浦源,获得8～15ps光脉冲。用条纹照相机和光学多道分析器测量了脉冲波形和光谱。计算机模拟了行波放大自发辐射的瞬态行为,计算结果与实验结果相符合。

关键词：放大自发辐射 ASE 脉宽梯度分布行波前进波泵浦光强

细胞羧肽酶1调控小鼠睾丸初级精母细胞GC-2增殖的作用与机制研究

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中国医药导报 2022年第32期19卷 10-13,30页

作者：张婷王万伦刘桐佳刘爽边艳超张传领肖瑞内蒙古医科大学内蒙古自治区分子病理学重点实验室内蒙古呼和浩特010059 内蒙古医科大学药学院内蒙古呼和浩特010110

目的探讨细胞羧肽酶1(CCP1)在小鼠睾丸初级精母细胞(GC-2)增殖中的作用及分子机制。方法体外正常培养GC-2细胞,利用含有空载质粒与CCP1重组质粒的慢病毒感染GC-2细胞构建阴性对照组(NC组)与CCP1过表达组(GC-2+CCP1组)细胞。CCK-8法与流... 详细信息

目的探讨细胞羧肽酶1(CCP1)在小鼠睾丸初级精母细胞(GC-2)增殖中的作用及分子机制。方法体外正常培养GC-2细胞,利用含有空载质粒与CCP1重组质粒的慢病毒感染GC-2细胞构建阴性对照组(NC组)与CCP1过表达组(GC-2+CCP1组)细胞。CCK-8法与流式细胞术分别检测CCP1过表达对GC-2细胞增殖与周期的影响;实时荧光定量PCR检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cdk2)、细胞周期蛋白B1(Ccnb1)和细胞周期蛋白D1(Ccnd1)的表达;Western blot检测Cdk2蛋白表达。结果CCK-8与流式细胞术结果显示,GC-2+CCP1组细胞的体外分裂增殖能力低于NC组,并发生了G_(2)/M期阻滞,差异有统计学意义(P<0.05)。GC-2+CCP1组细胞的CDK2 mRNA与蛋白表达高于NC组、Ccnb1与Ccnd1 mRNA低于NC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CCP1过表达可能通过影响细胞周期因子Cdk2、Ccnb1与Ccnd1的表达抑制GC-2细胞体外增殖能力发生G_(2)/M期阻滞。

关键词：细胞羧肽酶1 小鼠睾丸初级精母细胞细胞周期蛋白依赖性激酶2 细胞周期蛋白B1 细胞周期蛋白D1

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下乡随记

青春岁月 2019年第4期 72-72页

作者：王万伦云南省昭通市镇雄县非税收入管理局