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大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第4期52卷 21-27页

作者：王若瑄罗霞李宁求林强牛银杰梁红茹付小哲吕爱军天津农学院水产学院天津300384 中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室广东广州510380

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗... 详细信息

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1024000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。

关键词：大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳蛋白多克隆抗体

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鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制

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水产学报 2024年第5期48卷 56-64页

作者：张秋爽叶彩媚牛银杰林强梁红茹罗霞李宁求付小哲中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc (Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制，本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白，初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白)；Co-IP结果显示，SCRV的N蛋白与Sc-c-My... 详细信息

为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc (Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制，本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白，初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白)；Co-IP结果显示，SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段，并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag；将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系)，荧光共定位结果显示，Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象；通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化，发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明，SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达，进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径，为SCRV防控提供了新的靶点。

关键词：鳜鳜弹状病毒(SCRV) 鳜c-Myc 蛋白互作谷氨酰胺代谢

大口黑鲈弹状病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2024年第4期46卷 379-384页

作者：孔明慧梁红茹李宁求林强牛银杰罗霞马宝福付小哲上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院珠江水产研究所农村农业部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术与绿色养殖重点实验室广东广州510380

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通... 详细信息

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。

关键词：大口黑鲈弹状病毒 Taq Man荧光定量PCR N基因

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纳米酶在农业方向的研究进展

仲恺农业工程学院学报 2024年第1期37卷 67-73页

作者：马宝福付小哲林强牛银杰罗霞梁红茹李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所广东广州510380 农业农村部渔用药物创制重点实验室广东广州510380 广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室广东广州510380

纳米酶作为一种具有类酶活性的新型纳米材料,在抗逆改良、食品检测、食品加工与保鲜、植物保护和种子处理等方向具有广泛的应用前景.文章对纳米酶的定义、分类及其在农业方向的应用进行了综述,对目前存在的问题进行了探讨,并对其未来的... 详细信息

纳米酶作为一种具有类酶活性的新型纳米材料,在抗逆改良、食品检测、食品加工与保鲜、植物保护和种子处理等方向具有广泛的应用前景.文章对纳米酶的定义、分类及其在农业方向的应用进行了综述,对目前存在的问题进行了探讨,并对其未来的发展方向进行了展望.

关键词：农业食品纳米酶

Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白进化踪迹分析

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Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白进化踪迹分析

作者：牛银杰中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄动物引起的一种高度接触性传染病。FMDV易变异,已确定FMDV有7个血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型。其中,Asial FMDV主要流行于亚洲国家,严重影响了畜牧业... 详细信息

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄动物引起的一种高度接触性传染病。FMDV易变异,已确定FMDV有7个血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型。其中,Asial FMDV主要流行于亚洲国家,严重影响了畜牧业及贸易的健康发展。目前,关于Asial FMDV衣壳蛋白的功能研究还不是特别清楚。为研究VP1～VP4衣壳蛋白序列中的重要功能残基,利用同源建模方法构建出毒株Asial/YS/CHA/05的VP1～P4四聚体全长结构初始模型,而后对初始模型进行优化。利用PROCHECK在线程序对模型质量进行评价,结果表明所建模型结构可靠合理。依据晶体结构1FOD,利用DS2.5软件重叠构建Asial FMDV完整的二十面对称结构模型,可用于预测Asial FMDV病毒的衣壳蛋白序列中的重要功能残基。采用进化踪迹(Evolutionary Trace, ET)分析对52个Asial FMD毒株的衣壳蛋白VP1～VP4氨基酸序列进行分析,确定序列中共有71个组特异残基。ET分析中,依据10分区(P01～P10)对进化树进行分割,结果显示,Asial FMDV衣壳蛋白序列相对比较保守。在P05分区中,毒株划分成了5组,分别命名为AGld, AGle, AGlf, AGlg, AGlh。每个分组都有自己独特的组特异残基：AG1d组的组特异残基为134D (VP3)和219Q(VP3);AGle的组特异残基为134E(VP3)和219E(VP3);AGlf的组特异残基为204A(VP2)和214L(VP2),1O1Q(VP1);AGlg组特异残基为204S(VP2)和214M(VP2),1O1H(VP1);AGlh的为86D(VP2),173M(VP2),134E(VP3),41R(VP1)和100C(VP1),这些组特异残基为各个分组的分子标记。近几年流行Asial FMD毒株分属AGld, AGlf, AGlh组,其中2005-2007年中国分离毒株属于AGld组,2005年香港分离毒株属于AGlf组,2009年巴基斯坦分离毒株株属于AGlh组,表明近几年流行的Asial FMDV可能具有不同的来源。利用构建的三维模型结构与A、C和O型结构比对,预测Asial FMDV衣壳蛋白的抗原区域。结果显示,三个衣壳蛋白上可能共有9个抗原区域：VP1的BC loop (37～52aa (amino acid)). VP1的GH loop(135～154aa)和C端(185～211aa).VP2的EF loop(70～77aa),VP2的GH loop(84～90aa)、VP2的BC loop(131～135aa)、VP3的EF loop(56-77aa)和C端(214-219aa)、VP3的BC loop(126～134aa),其区域中的23个组特异残基可能是重要的抗原氨基酸位点。通过非对称单元模型结构鉴定位于相互作用界面上的氨基酸残基,对氨基酸性质进行分析并利用踪迹分析方法对残基保守性进行分析。结果显示,共228个氨基酸残基位于相互作用界面上,其中164个为ACRs,20个组特异残基,提示Asial FMDV毒株的装配可能存在差异。作用界面残基中以碱性残基为主,这可能是Asial FMDV粒子不耐酸的原因之一。本研究构建的模型结构、预测的抗原性区域和鉴定位于相互作用界面的氨基酸残基对进一步的实验研究提供了有益的参考数据。

关键词： Asial口蹄疫病毒衣壳蛋白进化踪迹分析同源建模

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大口黑鲈蛙病毒分子流行病学及组织病理分析

水产学报 2022年第6期46卷 1063-1073页

作者：杨展展林强付小哲罗霞刘礼辉梁红茹牛银杰左绍志张晓婷李宁求上海海洋大学水产与生命学院中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室

为探讨大口黑鲈蛙病毒(LMBV)的分子流行规律及在感染后的组织病理变化，实验对2019—2021年采集的723份患病大口黑鲈样品进行荧光定量PCR (qPCR)检测。结果显示，LMBV的阳性率为63.62%，挑选阳性样品接种鳜脑细胞(Chinese perch brain c... 详细信息

为探讨大口黑鲈蛙病毒(LMBV)的分子流行规律及在感染后的组织病理变化，实验对2019—2021年采集的723份患病大口黑鲈样品进行荧光定量PCR (qPCR)检测。结果显示，LMBV的阳性率为63.62%，挑选阳性样品接种鳜脑细胞(Chinese perch brain cells,CPB)，共获得93株LMBV。通过对分离株MCP、ATP酶、DNA聚合酶和甲基转移酶基因进行PCR扩增与测序分析，发现上述基因在LMBV分离株中均保守，其中MCP、ATP酶基因一致性均为100.0%、甲基转移酶基因一致性为99.7%～100.0%、DNA聚合酶基因一致性为99.8%～100.0%。选取1株LMBV毒株感染健康大口黑鲈，采用qPCR方法对不同组织中的病毒载量进行检测，结果显示，大口黑鲈蛙病毒在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠和脑等组织中均有分布，人工感染LMBV后的前5天病毒载量逐步升高；感染后第5天，心脏中病毒载量最高(9.5×10~5个/mg拷贝)，脑组织中病毒载量最低(2.9×10~2个/mg拷贝)。组织病理结果表明，LMBV可导致大口黑鲈多种组织坏死，其中肝脏、肾脏和心脏病变较为严重，典型病理特征包括肝细胞排列紊乱、肝窦扩张、核质疏散；肾组织细胞疏散、巨噬细胞破裂；心室外膜纤维坏死等。实验结果可为大口黑鲈蛙病毒病防控提供参考。

关键词：大口黑鲈蛙病毒分子流行病学组织病理荧光定量PCR (qPCR)

Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白进化踪迹分析

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 615-619页

作者：牛银杰王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为预测口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白的重要功能残基,本研究利用进化踪迹及蛋白结构同源建模等方法对91株Asia 1型FMDV的VP1氨基酸序列进行分析,结果显示91个病毒株分属于B、C和D分支,2005年~2006年分离株处于另一个分支,命名为E分支。以1... 详细信息

为预测口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白的重要功能残基,本研究利用进化踪迹及蛋白结构同源建模等方法对91株Asia 1型FMDV的VP1氨基酸序列进行分析,结果显示91个病毒株分属于B、C和D分支,2005年~2006年分离株处于另一个分支,命名为E分支。以10分区分析进化树,共34个组特异残基,其中140S、141S、146L、148A、149L、150A、151R、152R、153V、155N和156R分布于G-H环区域,预测它们与抗原性和受体结合特性有关;B、C、D和E 4个分支的组内特异残基分别为24S、153G、196H;59H、141P、146M、150S、169N;50I、135A和99N、127S、140S、151R,这些残基为各分支的分子标识;组特异残基35V、80L、93S、127A分布于VP1和其他结构蛋白的作用界面,可能对病毒的装配具有重要作用。本研究结果为FMDV的VP1功能研究提供了参考数据。

关键词： Asia 1型口蹄疫病毒 VP1蛋白踪迹进化分析同源建模

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浅谈大口黑鲈无病毒亲本选育技术

海洋与渔业 2023年第2期 96-97页

作者：余明海林强付小哲罗霞梁红茹牛银杰李宁求邓德基仲恺农业工程学院动物科技学院中国水产科学研究院珠江水产研究所广东德权渔业发展有限公司

大口黑鲈,近年来正如火如荼地在全国推广养殖,据《2022中国渔业统计年鉴》统计,2021年全国养殖产量已突破70万吨.目前苗种繁育企业、养殖户平均育苗成活率不足10%;其中,亲鱼产卵期间的损耗成为直接导致苗种繁育企业亏损的主要原因.如何... 详细信息

大口黑鲈,近年来正如火如荼地在全国推广养殖,据《2022中国渔业统计年鉴》统计,2021年全国养殖产量已突破70万吨.目前苗种繁育企业、养殖户平均育苗成活率不足10%;其中,亲鱼产卵期间的损耗成为直接导致苗种繁育企业亏损的主要原因.如何做好后备亲鱼选择以及亲鱼产前营养强化、减少亲鱼损耗、增加产卵数量,公开研究报道较少.

关键词：企业亏损育苗成活率苗种繁育后备亲鱼大口黑鲈养殖产量中国渔业统计亲本选育

一株新型大口黑鲈双RNA病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

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水产学报 2021年第9期45卷 1584-1591页

作者：罗明菊李宁求林强牛银杰刘礼辉梁红茹罗霞付小哲上海海洋大学水产与生命学院中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室

为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus, LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RTPCR检测方法... 详细信息

为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus, LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RTPCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测。结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10mol,最佳退火温度分别为64.1℃和61.5℃,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为10~2 PFU/mL,与第1轮PCR相比,灵敏度均提高了10 000倍,同时检测9种不同病毒,仅LBBV出现明亮特异性条带,在304个样品中,第1轮PCR检出阳性样品14株,检出率为4.60%,巢式RT-PCR检出阳性样品28株,检出率为9.21%;本实验建立的巢式RT-PCR检测方法灵敏度高且特异性好,可用于LBBV的早期检测及防控。

关键词：大口黑鲈双RNA病毒巢式RT-PCR 检测方法