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基于定向进化技术提高呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性

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南京农业大学学报 2024年第4期 750-759页

作者：李越池慧兵牛家峰马斌周慧敏朱萍吕凤霞南京农业大学食品科学技术学院

[目的]呕吐毒素（deoxynivalenol, DON）C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子... 详细信息

[目的]呕吐毒素（deoxynivalenol, DON）C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改造，以期获得催化活性显著提高的突变酶，提高其工业化应用的潜力。[方法]通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法，构建突变文库，经高通量筛选后，对催化活性明显提高的突变体进行酶学性质表征。同时，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，探究突变酶催化活性提高的分子机制。[结果]成功筛选到突变酶S2、S10和S12,与野生型相比，其比活力分别提高207%、293%和258%。动力学参数结果显示，突变酶S2、S10和S12的Km值分别为56.89、27.00和40.65μmol·L-1,是野生型的91.7%、43.5%和65.5%;kcat/Km值分别为327.30、576.67和380.07 L·mmol-1·s-1,是野生型的1.25、2.20和1.45倍，相比野生型，突变酶亲和力和催化效率均显著提高。此外，分子动力学模拟和三维结构模拟分析结果表明，柔性增加、底物DON的进攻距离缩短、氢键增加、疏水性增加和远端效应是导致其催化活性提高的主要原因。[结论]本研究通过易错PCR和DNA shuffling相结合的定向进化策略有效提高了呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性，为其工业化应用提供试验依据。

关键词：呕吐毒素解毒酶定向进化催化活性分子动力学模拟

基于理性设计策略提高呕吐毒素解毒酶DepB的催化活性

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南京农业大学学报 2024年

作者：周慧敏牛家峰池慧兵马斌朱萍陆兆新吕凤霞南京农业大学食品科学技术学院

[目的]呕吐毒素(DON)广泛存在于粮谷类原料及其制品中，对人和动物的健康都造成严重危害。然而，现有呕吐毒素解毒酶存在种类少、催化性能差等问题，限制了其在食品加工和饲料中的应用。本研究采用理性设计策略对呕吐毒素解毒酶DepB进... 详细信息

[目的]呕吐毒素(DON)广泛存在于粮谷类原料及其制品中，对人和动物的健康都造成严重危害。然而，现有呕吐毒素解毒酶存在种类少、催化性能差等问题，限制了其在食品加工和饲料中的应用。本研究采用理性设计策略对呕吐毒素解毒酶DepB进行分子改造，以提高DepB的催化活性。[方法]通过对底物10 ?范围内的氨基酸残基进行丙氨酸和甘氨酸扫描，确定突变“热点”氨基酸残基。随后，采用定点饱和突变和组合突变技术筛选得到催化活性显著提高的突变酶，并对其进行三维结构模拟和分子动力学模拟，分析其催化活性提高的分子机制。[结果]获得了催化活性显著提高的三点突变酶A289V/A227R/S54N，该酶比活力为335.77 U·mg-1，是野生型DepB的2.25倍。动力学参数显示，三点突变酶的Km值由95.11 μmol·L-1下降到58.33 μmol·L-1，kcat/Km比值由5.99 mmol-1·L·s-1提高至16.94 mmol-1·L·s-1，亲和力和催化效率均显著提高。通过三维结构模拟和分子动力学模拟分析，发现空间位阻减小、静电相互作用增强、酶-底物-辅酶结合自由能降低是其催化活性提高的分子机制。[结论]基于理性设计策略提高了DepB的催化活性，强化了DepB的适用性能，为呕吐毒素解毒酶的分子改造及其在食品加工和饲料中的应用提供依据。

关键词：呕吐毒素解毒酶 DepB 催化活性理性设计分子机制

基于定向进化技术提高呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性

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南京农业大学学报 2023年

作者：李越池慧兵牛家峰马斌周慧敏朱萍吕凤霞南京农业大学食品科学技术学院

[目的]呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改... 详细信息

[目的]呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改造，以期获得催化活性显著提高的突变酶，提高其工业化应用的潜力。[方法]通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法，构建突变文库，经高通量筛选后，对催化活性明显提高的突变体进行酶学性质表征。同时，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，探究突变酶催化活性提高的分子机制。[结果]成功筛选到突变酶S2、S10和S12，与野生型相比，比活力分别提高了207%、293%和268%。动力学参数结果显示，突变酶S2、S10和S12的Km值分别为56.89、27.00和40.65 μmol·L-1，是野生型的91.7%、43.5%和65.5%，kcat/Km值分别为327.30、576.67和380.07 L·mmol-1·s-1，是野生型的1.25、2.20和1.45倍，相比野生型，突变酶亲和力和催化效率均显著提高。此外，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，发现柔性增加、底物DON的进攻距离缩短、氢键增加、疏水性增加和远端效应是导致其催化活性提高的主要原因。[结论]本研究通过易错PCR和DNA shuffling相结合的定向进化策略有效提高了呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性，为其工业化应用提供依据。

关键词：呕吐毒素解毒酶定向进化催化活性分子动力学模拟

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中国数字人系统应用于解剖学实验教学的效果

菏泽医学专科学校学报 2023年第2期35卷 95-96,F0003页

作者：牛家峰张东方杨舒乔菏泽医学专科学校山东菏泽274000 青岛市中医医院(海慈医院) 山东青岛266000

目的探讨中国数字人系统应用于医学高职人体解剖学实验教学的效果。方法将2022级康复专业两个合堂班级分为观察组(118人)和对照组(120人),观察组在实验教学过程中使用中国数字人系统,对照组采用传统实验课教学方法。比较两组学生的期末... 详细信息

目的探讨中国数字人系统应用于医学高职人体解剖学实验教学的效果。方法将2022级康复专业两个合堂班级分为观察组(118人)和对照组(120人),观察组在实验教学过程中使用中国数字人系统,对照组采用传统实验课教学方法。比较两组学生的期末考试成绩、实验课随堂测试成绩以及两组学生对不同实验课教学方法的认可度和接受度。结果两组学生期末考试成绩比较,P<0.05;两组学生实验课随堂测试成绩比较,P<0.05;两组学生对不同教学方式的认可度和接受度比较,P<0.05。结论中国数字人系统应用于人体解剖学实验教学,可以有效提高学生的期末考试成绩、随堂测试成绩,且学生认可度和接受度较高。

关键词：中国数字人系统解剖学实验教学

地衣芽孢杆菌Ⅰ型L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及分泌途径研究

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地衣芽孢杆菌Ⅰ型L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及分泌...

作者：牛家峰南京农业大学

学位级别：硕士

L-天冬酰胺酶(EC 3.***.1.1)属于酰胺水解酶,特异性的将L-天冬酰胺水解为L-天冬氨酸并释放氨气。L-天冬酰胺酶在食品和医药领域具有重要的应用价值,在医药领域广泛应用于急性淋巴细胞白血病(ALL),霍奇金淋巴瘤,乳腺癌以及胰腺癌等疾病的... 详细信息

L-天冬酰胺酶(EC 3.***.1.1)属于酰胺水解酶,特异性的将L-天冬酰胺水解为L-天冬氨酸并释放氨气。L-天冬酰胺酶在食品和医药领域具有重要的应用价值,在医药领域广泛应用于急性淋巴细胞白血病(ALL),霍奇金淋巴瘤,乳腺癌以及胰腺癌等疾病的治疗。L-天冬酰胺作为癌细胞和正常细胞的营养元素之一,由于这些癌细胞缺少L-天冬酰胺合成酶活性,L-天冬酰胺酶可以通过水解血液中的L-天冬酰胺来达到―饿死‖癌细胞的作用,而对正常细胞没有影响。除了在医疗领域的应用之外,L-天冬酰胺酶还可以通过水解食品中的L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)来降低高温油炸、烘焙食品中的丙烯酰胺的含量,而对产品的营养、色泽、感官以及风味没有显著的影响。L-天冬酰胺酶来源广泛,微生物、动物、植物中均有分布,其中微生物源的L-天冬酰胺酶被认为是应用在食品和医疗领域最为理想的来源。然而,目前商品化的L-天冬酰胺酶仍然主要来源于大肠杆菌和欧文氏菌等少数菌株;而且被国外公司所垄断(诺维信和帝斯曼),国内迫切需要开展相关的研究;此外,考虑到食品安全问题,,大肠杆菌并不适合L-天冬酰胺酶的生产。具有GRAS(Generally regarded as safe)状态和拥有强大蛋白分泌能力的枯草芽孢杆菌表达系统被认为是生产食品和医药用蛋白的理想宿主。本研究实现了地衣芽孢杆菌I型L-天冬酰胺酶(BlAase)在枯草芽孢杆菌中的高效表达与分泌,并对其分泌途径做了系统的研究。同时通过表达元件的改造等手段进一步提高了L-天冬酰胺酶的表达水平。这对改善国内研究现状,具有重要意义。本研究结果分述如下:1.BlAase在枯草芽孢杆菌中的分泌表达本章成功实现了BlAase在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达与分泌。有趣的是,BlAase的分泌并不需要N端信号肽的介导。在发酵72 h后,BlAase的胞内外酶活分别达到了215.41和107.16 U/m L,具有较高的表达水平。对BlAase的产酶曲线研究发现,发酵12 h,胞内积累了大量蛋白,在发酵第24 h后,胞内酶活达到了最大值348.31 U/m L,而胞外样品在发酵培养48 h后才可以检测到酶活。在进入稳定中期之后,胞外酶活呈指数增长,发酵96 h后,胞内外酶活分别达到了147.02和279.03 U/m L,总酶活达到了426 U/m L。由于BlAase的分泌并不需要N端信号肽的介导,因此,为研究BlAase在分泌过程中是否存在潜在的N端序列的切割,对BlAase的N端氨基酸做了测序。通过BlAase的N端测序发现,BlAase的N端序列是完整的,与理论氨基酸序列一致(MKKKVALITT),说明该酶在分泌过程中不存在N端氨基酸序列的切除,因此,推测BlAase的分泌可能不是通过经典分泌途径实现分泌的,而是通过一种未知的分泌途径(非经典分泌途径)实现分泌的。2.BlAase在枯草芽孢杆菌中分泌途径研究为证明BlAase是通过非经典分泌途径实现分泌的,需要排除BlAase是由于菌体裂解或通过经典分泌途径(Sec和Tat分泌途径)实现分泌的可能性。研究发现,BlAase的分泌并不是简单的由于菌体裂解造成的。进一步研究证明,BlAase也不是通过Sec-和Tat-依赖性的分泌途径实现分泌的。同时,通过BlAase的N端和C端切除实验证明了BlAase的N端和C端序列对其表达和分泌至关重要,因此,间接证明BlAase是通过非经典分泌途径实现分泌的。为进一步探索BlAase的分泌能力,将BlAase作为信号肽来引导其他外源蛋白的表达与分泌,其中5个蛋白中的2个在BlAase的介导下成功实现了表达于分泌,为研究重组蛋白的表达与分泌提供了新的研究方向。3.基于表达元件优化提高BlAase在枯草芽孢杆菌中的表达水平虽然BlAase已在枯草芽孢杆菌中成功表达和分泌,但过低的产量限制了其在工业上的应用。因此,本研究通过转录和翻译相结合的策略来提高BlAase在枯草芽孢杆菌中的表达水平。(i)强启动子的替换,选择15个强启动子来替换原始质粒上的启动子P43,其中启动子Pyvy D的表达水平最高,发酵72 h后,其酶活达到了436.28 U/m L,是出发菌株表达水平的1.25倍。(ii)为进一步提高BlAase的表达水平,将四个具有较高BlAase表达水平的启动子(Pyvy D,P43,Papr E和Pspo VG)进行两两串联,构建了16个双启动子表达系统,在串联启动子Papr E-Pyvy D的驱动下,BlAase表达水平达到了502.11 U/m L。此外,通过改造启动子Papr E-Pyvy D的核心区域(-35和-10区),进一步提高了BlAase的表达水平,其酶活达到了568.59 U/m L,是出发菌株表达水平的1.63倍。(iii)通过替换启动子Pyvy D的核糖体结合位点(RBS)序列,BlAase酶活达到了790.1U/m L,是出发

关键词： L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌表达系统非经典分泌途径融合表达表达元件

IFN-α和IFN-γ对MHC-I类链相关蛋白A的相反作用及其机制探讨

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IFN-α和IFN-γ对MHC-I类链相关蛋白A的相反作用及其机制探讨

作者：牛家峰山东省医学科学院

学位级别：硕士

目的NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,具有广泛的生物学功能,位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线;不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞,同时又能通过早期分泌多种细胞因子（如IFN-γ、GM-CSF和TNF-β）和趋化因... 详细信息

目的NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,具有广泛的生物学功能,位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线;不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞,同时又能通过早期分泌多种细胞因子（如IFN-γ、GM-CSF和TNF-β）和趋化因子来调节获得性免疫应答,因此,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。NK细胞及其分泌的细胞因子不仅参与调节天然免疫和获得性免疫,而且参与调节造血系统的功能,在血液系统疾病,尤其是异基因骨髓移植中,在抑制和预防GVHD,促进GVT效应和促进血液和免疫系统重建方面起重要作用。同时,NK细胞对自身免疫性疾病的调节亦引起了人们的重视。因此,尽管关于NK细胞的发育分化和识别功能的研究远远滞后于T细胞和B细胞,近年来,关于NK细胞功能和调节的研究引起了人们极大的兴趣,并有了突飞猛进的发展,成为免疫学研究的一大热点。近期的研究发现,NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体,NK细胞的效应功能取决于活化信号与抑制性信号的综合。抑制性受体能特异性识别靶细胞表面的MHC-I类分子并保护正常细胞不被杀伤,人的NK细胞抑制性受体主要有杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell Ig-like receptors, KIR）和凝集素样受体CD94/NKG2A,在调节NK细胞功能方面起重要作用。活化受体识别经典、非经典的MHC-I类分子或MHC-I类相关分子,在NK活化的启动方面起关键作用,其中尤为引人注目的是NKG2D,NKG2D的配基为非经典的MHC样分子MICA （MHC class I chain-related protein A）、MICB及ULBP -1,2,3,4（UL16-binding protein-1,2,3,4）,这些分子在许多上皮及非上皮来源的肿瘤细胞、病毒感染细胞和受到“应激性刺激”的细胞均有表达或上调。研究表明,NKG2D的单独活化即足以刺激NK细胞的活化,并能克服抑制性受体的强势信号,因此,在NK细胞活化过程中起着举足轻重的作用。而NKG2D配体的表达水平,可能决定着NKG2D的活化与否。目前,对MICA的结构与功能,以及与疾病关系等方面的研究都取得重要进展,但对其表达调控机制的研究却很少。干扰素是机体抗肿瘤免疫应答的重要免疫调节剂。I型干扰素（IFN-α和IFN-β）具有抑制病毒复制、抑制细胞增殖、抗肿瘤等多种生物学功能。II型干扰素（IFN-γ）,又称免疫干扰素,是由Th1细胞和NK细胞分泌的多功能性细胞因子,是重要的免疫应答调节剂,能激活单核巨噬细胞,诱导多种细胞表达MHC I类和II类分子而增强抗原递呈,促进Th0细胞向Th1分化等。IFN-α是经典的NK细胞活化剂,已广泛用于多种实体瘤和病毒性肝炎的治疗,但IFN-γ对肿瘤的临床疗效却不尽如人意。本实验室研究发现IFN-α和IFN-γ对NK细胞受体的调节作用是相反的,IFN-α可上调活化性受体NKG2D表达,下调抑制性受体NKG2A表达,而IFN-γ的作用则恰恰相反。MICA和MICB5’侧翼区均含有一段与热休克蛋白70基因启动子热休克应答元件相似的调控序列,基因在应激条件下的诱导表达与该序列的活化有关,上调MICA表达的应激刺激亦能上调HSP70的表达。最近研究发现,IFN-α可上调HSP70的表达,而IFN-γ下调HSP70表达;IFN-α可诱导树突状细胞表达MICA分子;金属基质蛋白酶（MMPs）的剪切作用可削弱细胞膜表面MICA分子的表达,而IFN-γ可增强MMPs的剪切功能。因此推测两者可能对人肿瘤细胞NKG2D配体MICA分子的表达在多级水平存在相反的调节作用。本研究中,我们首先观察了IFN-α和IFN-γ对人宫颈癌细胞（HeLa和Caski）及血液系统肿瘤（K562和Raji）MICA表达的影响,并且观察了MICA表达的变化对NK细胞识别与杀伤的影响,以期探讨IFN-α和IFN-γ是否相反地调节了MICA的表达,并影响了肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。进一步,我们构建了pGL3/MICA-promoter萤光报告重组载体,观察了IFN-α和IFN-γ是否通过调节MICA启动子转录活性影响MICA的表达。同时,观察了IFN-γ能否通过增强金属基质蛋白酶的剪切功能而使肿瘤细胞的膜结合型MICA脱落形成可溶性MICA。从而在转录水平和翻译后水平两方面探讨MICA表达的调控机制。方法 1.RT-PCR法检测MICA mRNA的表达 2.免疫组化法鉴定MICA蛋白的表达 3.MTT法检测人外周血NK细胞对肿瘤细胞的杀伤 4.MICA启动子克隆载体的构建: 酚氯仿法提取基因组DNA,PCR法扩增MICA启动子序列,与pMD18

关键词：肿瘤天然杀伤细胞干扰素 MICA NKG2D 启动子

MHC I类链相关蛋白A的表达调控与抗肿瘤免疫

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现代免疫学 2006年第4期26卷 343-345页

作者：牛家峰张彩山东省医学科学院基础医学研究所济南250062

MHC I类链相关蛋白A(MICA)是非经典的HLA I类分子,是活化性受体NKG2D的配体,在感染、肿瘤及细胞应激情况下表达上调,其表达量及形式的变化,直接影响多种免疫效应细胞功能表现。本文就近年来对MICA的表达调控以及与抗肿瘤免疫关系方面进... 详细信息

MHC I类链相关蛋白A(MICA)是非经典的HLA I类分子,是活化性受体NKG2D的配体,在感染、肿瘤及细胞应激情况下表达上调,其表达量及形式的变化,直接影响多种免疫效应细胞功能表现。本文就近年来对MICA的表达调控以及与抗肿瘤免疫关系方面进行综述。

关键词： MICA NKG2D 肿瘤

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基于心理落差测度的共识决策方法及应用

系统工程理论与实践 2024年

作者：周谧牛家强吴坚上海海事大学经济管理学院合肥工业大学管理学院

针对目前已有群体共识研究大多都忽略了决策者心理感知和实际评价差异之间关系的不足，提出了一种基于心理落差测度的共识决策方法. 首先，本文提出了空间距离测度和序测度，并基于此构建了求解决策者最优权重的线性规划模型. 其次，... 详细信息

针对目前已有群体共识研究大多都忽略了决策者心理感知和实际评价差异之间关系的不足，提出了一种基于心理落差测度的共识决策方法. 首先，本文提出了空间距离测度和序测度，并基于此构建了求解决策者最优权重的线性规划模型. 其次，将韦伯费希纳心理物理学定律拓展到群体共识过程之中，提出了基于群体决策的心理落差概念，并定义了心理落差测度; 该测度能够较好地刻画评价差异刺激带给决策者的主观感受，进而能够量化决策者对群体意见的接受程度. 在此基础上，提出了心理阈值的概念，并给出了确定心理阈值的方法; 本文所提心理阈值是根据决策环境客观确定的，且能够满足不同评价层次对阈值的差异性需求. 然后，设计了基于心理阈值的调整反馈机制. 最后，通过物流企业智能化水平评价的案例研究和对比分析，验证了本文所提方法的可行性和有效性.

关键词：群体共识心理落差心理阈值决策者权重空间距离测度序测度

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高通量测序分析混合菌群中的呕吐毒素降解菌

食品科学 2021年第24期42卷 123-130页

作者：高慧牛家峰杨华陆兆新陈美容吕凤霞南京农业大学食品科技学院江苏南京210095

为筛选具有降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)能力的微生物,利用高通量测序方法分析混合菌群中的DON降解菌。从土壤中获得具有DON降解能力的混合菌群LG-6,并发现不同梯度稀释倍数的混合菌群之间DON降解效果具有明显差异。稀释... 详细信息

为筛选具有降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)能力的微生物,利用高通量测序方法分析混合菌群中的DON降解菌。从土壤中获得具有DON降解能力的混合菌群LG-6,并发现不同梯度稀释倍数的混合菌群之间DON降解效果具有明显差异。稀释至10^(-7)时混合菌群LG-6-7能完全降解DON,而稀释至10^(-8)时混合菌群LG-6-8不能降解DON。对这2个混合菌群的微生物多样性进行分析,发现混合菌群LG-6-7包括假苍白杆菌属、节细菌属、假单胞菌属、代尔夫特菌属和德沃斯氏菌属,而混合菌群LG-6-8包括假苍白杆菌属和节细菌属。故推测假单胞菌属、德沃斯氏菌属和代尔夫特菌属在降解DON的过程中必不可少。此外,假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合培养时,48 h内完全降解DON。该混合菌群培养温度为37℃、pH 7.0,培养基为MMT培养基,并发现该混合菌群是通过微生物代谢产生的酶对DON进行降解。本研究发现能完全降解DON的假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群,为呕吐毒素生物脱毒剂的研发提供一定理论依据。

关键词：呕吐毒素降解微生物多样性分析假单胞菌属德沃斯氏菌属