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作者：熊文汶华中农业大学

学位级别：硕士

关于马铃薯遗传转化方面的研究，长期以来一直受到极端杂合性和四体遗传模式的阻碍，于自交亲和的纯合二倍体中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，能更加高效地研究马铃薯基因功能并实现品种改良。基于此，本研究优化了马铃薯CRISPR基因编... 详细信息

关于马铃薯遗传转化方面的研究，长期以来一直受到极端杂合性和四体遗传模式的阻碍，于自交亲和的纯合二倍体中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，能更加高效地研究马铃薯基因功能并实现品种改良。基于此，本研究优化了马铃薯CRISPR基因编辑体系，并在AC142、E3、SVA4-1中都实现了双靶点的敲除，具体内容如下:　　1.以控制白化表型的八氢番茄红素脱氢酶基因(StPDS)为靶标基因，对本实验室已构的不同载体骨架和启动子驱动的CRISPR载体，于马铃薯AC142和E3中进行编辑效率的验证，在农杆菌介导的稳定转化中筛选出编辑效率最高的载体HM4,将得到的CR-AC142-StPDS嵌合株系进行短期循环热处理，调整热处理的频率和光照，发现37℃光照16h/22℃黑暗8h循环热激15d，分离出腋芽100％突变的效率最高，该热处理方式获得完全突变体的概率达到9.7％,建立并优化了马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系。　　2.对本研究前期获得的表型上白绿嵌合和完全白化的CR-PDS株系进行TA克隆、PCR/RE和Hi-Tom测序。结果表明，PCR/RE只能说明酶切位点是否突变，TA克隆和Hi-Tom都能定量分析不同株系的基因编辑类型，但是TA克隆成本高、通量低，从而筛选出Hi-Tom作为本研究鉴定CRISPR/Cas9突变体的最优方法。　　3.通过以上优化的马铃薯基因编辑体系，在AC142中得到了CR-StSP6A敲除株系，于试管苗、生长室和大棚中验证了该基因调控结薯的功能，从而证明本研究的体系在反向遗传学研究中的实用性。　　4.对纯合二倍体马铃薯SVA4-1进行自交亲和等农艺性状的鉴定，并建立稳定的遗传转化体系，利用以上优化并成功应用的马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系，对SVA4-1进行敲除，获得3个SvPHYF被部分编辑的嵌合体。本研究双靶点敲除的CRISPR体系在该自交亲和二倍体上的应用，为进行马铃薯双基因遗传互补研究奠定了基础。　　综上所述，本研究构建并优化了马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系，并在功能基因验证和自交亲和二倍体中得到初步应用，为马铃薯基因功能的研究提供了技术支持。

关键词：马铃薯基因编辑功能验证

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基于热处理CRISPR/Cas9马铃薯植株的基因编辑体系优化

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园艺学报 2023年第12期50卷 2591-2600页

作者：熊文汶刘慧敏陈凯园杜鹃宋波涛景晟林华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学教育部重点试验室农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点试验室湖北武汉430070 华中农业大学植物科学技术学院作物遗传改良全国重点实验室湖北武汉430070

以二倍体马铃薯栽培种AC142和四倍体栽培种E3为试验材料,构建并优化了马铃薯内源启动子驱动的CRISPR/Cas9基因编辑体系。以控制白化表型的八氢番茄红素脱氢酶基因(StPDS)为靶标基因,通过农杆菌介导的遗传转化侵染试管薯,根据转化效率和... 详细信息

以二倍体马铃薯栽培种AC142和四倍体栽培种E3为试验材料,构建并优化了马铃薯内源启动子驱动的CRISPR/Cas9基因编辑体系。以控制白化表型的八氢番茄红素脱氢酶基因(StPDS)为靶标基因,通过农杆菌介导的遗传转化侵染试管薯,根据转化效率和表型突变频率的分析,筛选出马铃薯内源启动子StU6和StUBI10驱动的HM4载体为最优CRISPR载体。以常温处理为对照,对HM4获得的AC142的37个全绿株系和白绿嵌合株系、E3的4个全绿株系的侧芽进行循环8次的短期热处理(37℃24h+22℃24h)共15d,表型分析和测序检测表明,对敲除株系进行短期热处理能显著提高CRISPR/Cas9的编辑效率。常温下,AC142和E3敲除株系的表型突变频率分别为16.2%(6/37)和0(0/4),循环8次短期热处理之后,表型突变频率分别提高到54.1%(20/37)和75%(3/4)。其中,AC142敲除株系的侧芽能得到10.8%(4/37)白化株系,而E3未能得到白化株系,只能得到75%(3/4)的白绿嵌合株系。4次连续15 d的短期热处理后,2.1%(3/144)的E3敲除株系的侧芽可在常温下保持白化。对短期热处理后的白化植株进行TA克隆,测序结果显示二倍体敲除株系CR-AC142-StPDS-17/21和四倍体敲除株系CR-E3-StPDS-3/4的8~12个单克隆都不存在野生型,说明本研究的敲除体系可在马铃薯中实现对靶标序列的完全诱导突变。该体系可广泛应用于马铃薯突变体的创制,为马铃薯基因功能组学研究和目标性状精准改良提供技术基础。

关键词：马铃薯基因编辑 CRISPR/Cas9 StPDS 热处理

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番茄小孢子发育时期与花器形态的相关性

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甘肃农业大学学报 2024年第1期59卷 161-170页

作者：王凯彬王晓敏熊文汶付龙寇存莲申晓雨程国新郭猛高艳明李建设宁夏大学葡萄酒与园艺学院宁夏银川750021 宁夏现代设施园艺工程技术研究中心宁夏银川750021 宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室宁夏银川750021 宁夏设施园艺(宁夏大学)技术创新中心宁夏银川750021

【目的】明确番茄小孢子发育时期与花器形态的相关性,为番茄花药培养和小孢子培养提供理论和实际依据。【方法】以大粉果安纳西和大红果SV4224TH 2个番茄品种为材料,对不同发育时期花器各部分的颜色与大小进行测定与计算,采用改良苯酚... 详细信息

【目的】明确番茄小孢子发育时期与花器形态的相关性,为番茄花药培养和小孢子培养提供理论和实际依据。【方法】以大粉果安纳西和大红果SV4224TH 2个番茄品种为材料,对不同发育时期花器各部分的颜色与大小进行测定与计算,采用改良苯酚品红染色法进行小孢子细胞学观察。【结果】2个番茄品种小孢子发育均经历了单核早中期、单核靠边期、双核期和成熟花粉粒时期,且各发育时期细胞学特征明显;小孢子各发育时期与花器外观形态密切相关,当番茄花蕾较小(安纳西纵径为5.54~8.83 mm、横径为2.33~3.35 mm;SV4224TH纵径为5.44~9.19 mm、横径为2.38~3.56 mm),花萼略微裂开呈绿色,花冠呈浅绿色且花药呈浅黄色时,小孢子处于单核靠边期;当小孢子处于单核靠边期时,2个品种的单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径、横径呈极显著正相关,其相关系数分别为0.903、0.879和0.879、0.710,而与花蕾的纵横经比,花药的纵径、横径、纵横径比无极显著相关性;花蕾纵径在7.00~7.99 mm时,安纳西和SV4224TH单核靠边期小孢子占比最高,分别为98.50%和94.50%;花蕾横径在2.00~2.99 mm时,二者最高值分别为68.15%和61.55%。【结论】安纳西和SV4224TH的小孢子培养的最佳选蕾标准为花蕾纵径在7.00~7.99 mm,花萼略微裂开呈绿色,花冠呈浅绿色且花药呈浅黄色。

关键词：番茄小孢子花器形态发育时期单核靠边期

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