马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系的优化与应用

作     者：熊文汶 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋波涛

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：马铃薯 基因编辑 功能验证 

摘      要：关于马铃薯遗传转化方面的研究，长期以来一直受到极端杂合性和四体遗传模式的阻碍，于自交亲和的纯合二倍体中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，能更加高效地研究马铃薯基因功能并实现品种改良。基于此，本研究优化了马铃薯CRISPR基因编辑体系，并在AC142、E3、SVA4-1中都实现了双靶点的敲除，具体内容如下: 1.以控制白化表型的八氢番茄红素脱氢酶基因(StPDS)为靶标基因，对本实验室已构的不同载体骨架和启动子驱动的CRISPR载体，于马铃薯AC142和E3中进行编辑效率的验证，在农杆菌介导的稳定转化中筛选出编辑效率最高的载体HM4,将得到的CR-AC142-StPDS嵌合株系进行短期循环热处理，调整热处理的频率和光照，发现37℃光照16h/22℃黑暗8h循环热激15d，分离出腋芽100％突变的效率最高，该热处理方式获得完全突变体的概率达到9.7％,建立并优化了马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系。 2.对本研究前期获得的表型上白绿嵌合和完全白化的CR-PDS株系进行TA克隆、PCR/RE和Hi-Tom测序。结果表明，PCR/RE只能说明酶切位点是否突变，TA克隆和Hi-Tom都能定量分析不同株系的基因编辑类型，但是TA克隆成本高、通量低，从而筛选出Hi-Tom作为本研究鉴定CRISPR/Cas9突变体的最优方法。 3.通过以上优化的马铃薯基因编辑体系，在AC142中得到了CR-StSP6A敲除株系，于试管苗、生长室和大棚中验证了该基因调控结薯的功能，从而证明本研究的体系在反向遗传学研究中的实用性。 4.对纯合二倍体马铃薯SVA4-1进行自交亲和等农艺性状的鉴定，并建立稳定的遗传转化体系，利用以上优化并成功应用的马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系，对SVA4-1进行敲除，获得3个SvPHYF被部分编辑的嵌合体。本研究双靶点敲除的CRISPR体系在该自交亲和二倍体上的应用，为进行马铃薯双基因遗传互补研究奠定了基础。 综上所述，本研究构建并优化了马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑体系，并在功能基因验证和自交亲和二倍体中得到初步应用，为马铃薯基因功能的研究提供了技术支持。