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烟草NbbZIP28突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

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中国农业科学 2018年第14期51卷 2689-2699页

作者：何青云刘笑玮焦裕冰俞芳菲申莉莉杨金广王凤龙中国农业科学院烟草研究所

【目的】b ZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调... 详细信息

【目的】b ZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERs)因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0—48 h,采用q RT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具Plant CARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了10个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4—8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12—48 h,突变体中UPR相关基因Bi P、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5—7 d突变体中的病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥Atb ZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件(heat stress response element,HSE)、3个参与低温反应的顺式作用元件(low temperature response element,LTR)、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件(TC-rich repeats)。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。

关键词：内质网应激未折叠蛋白应答 NbbZIP28 病毒侵染烟草

本氏烟NbNAC062的克隆及对马铃薯Y病毒侵染的抑制作用

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中国农业科学 2021年第19期54卷 4110-4120页

作者：曲潇玲焦裕冰罗健达宋丽云李莹申莉莉杨金广王凤龙中国农业科学院烟草研究所

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方... 详细信息

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方法】以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料克隆NbNAC062,利用MEGA、UniProt、SMART、TMHMM Server2.0、Sol Genomics Network、PlantCARE等技术进行生物信息学分析;利用激光共聚焦与实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)明确PVY侵染前后NbNAC062蛋白定位及mRNA表达量变化;基于病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)和过表达技术,构建pTRV::NbNAC062沉默载体与pEarleyGate100::RFP::NbNAC062过表达载体,采用qRT-PCR和Western blot检测NbNAC062在本氏烟中沉默与过表达后,PVY的积累量变化及未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)相关基因BiP的表达差异。【结果】NbNAC062编码646个氨基酸,N端28—179 aa为NAC结构域,129—185 aa为DNA结合区域,C末端621—643 aa为疏水跨膜结构,系统进化树与蛋白序列分析表明本氏烟NbNAC062与渐狭叶烟草NaNAC062亲缘关系最近。NbNAC062启动子中包含脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸以及逆境响应相关的多种顺式作用元件。PVY侵染激活NbNAC062从细胞膜转移至细胞核,且诱导NbNAC062上调表达。PVY侵染本氏烟5、7 d,处理组NbNAC062mRNA水平分别为对照组的2.52、1.95倍;PVY侵染3 d,BiP mRNA表达量为对照组的2.39倍,PVY侵染7 d,BiP表达量极显著低于对照组,下调表达56.77%。本氏烟沉默NbNAC062并接种PVY,接种后3、5、7 d,与对照组相比,沉默组PVY CP mRNA上调表达,分别为对照组的2.12、2.41、1.38倍,BiP mRNA表达量则下调,分别下调28.19%、58.11%、10.77%,接种后5、7 d沉默组PVY CP蛋白含量亦显著高于对照组。过表达NbNAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP mRNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,BiP mRNA上调表达,分别为对照组的1.56、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。【结论】NbNAC062属于NAC类膜结合转录因子,可被PVY侵染激活转移至细胞核,可能通过调控UPR相关基因BiP的表达,促进细胞生存,抑制PVY早期侵染。

关键词： NbNAC062 马铃薯Y病毒基因沉默瞬时过表达

基于重组酶聚合酶扩增技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法的建立

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基于重组酶聚合酶扩增技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法的建立

四川烟草辣椒脉斑驳病毒的分离鉴定和RPA检测方法的建立

中国植物病理学会第十一届全国会员代表大会暨2018年学术年会

作者：焦裕冰蒋均匀夏子豪吴元华沈阳农业大学植物保护学院

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaicvirus,CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员之一,是世界范围内葫芦科作物上一种重要检疫性病毒,严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物生产。CGMMV可以通过种子、花粉、土壤、... 详细信息

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaicvirus,CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员之一,是世界范围内葫芦科作物上一种重要检疫性病毒,严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物生产。CGMMV可以通过种子、花粉、土壤、水和昆虫媒介以及机械接触传播。感染CGMMV植株叶片上会出现明显的花叶症状,生长发育迟缓,果实畸形,最终导致产量降低,从而引起巨大的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),一种新型的等温DNA扩增和检测技术,针对CGMMV-lnxg分离物基因组(GenBank ID:KY040049.1)序列的外壳蛋白序列设计特异性引物,引物设计长度为35bp,无需考虑Tm值。以摩擦接种CGMMV的葫芦叶片为材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,通过反应条件优化,特异性及灵敏度检测等试验,建立了一种新的快速检测CGMMV的方法。结果显示,RPA方法在37℃条件下恒温反应30min即可完成扩增,检测得到约180bp特异性条带,且与西瓜花叶病毒、小西葫芦花叶病毒、南瓜花叶病毒等其他葫芦科病毒均无交叉反应,特异性良好;反应产物分别使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(Sangon Biotech)、苯酚/氯仿溶液、65℃加热10min、95℃加热10min、5%SDS溶液及10%SDS溶液进行纯化处理后,试剂盒处理产物条带明亮单一;灵敏度试验分析表明,RPA法的检测灵敏度为3.02x101拷贝,使用普通PCR方法在此稀释度也可检测到目的条带,灵敏度较高。本文建立的RPA方法高效、便捷、省时、特异性好,为田间及基层实验室快速检测CGMMV提供了一种新的诊断方法。

关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV) 重组酶聚合酶扩增(RPA) 检测技术

来源： cnki会议评论

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四川烟草辣椒脉斑驳病毒的分离鉴定和RPA检测方法的建立

纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5的纳米硒化应用研究

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：焦裕冰李嘉伦徐传涛夏子豪吴元华沈阳农业大学植物保护学院

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinalmottle virus,ChiVMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的正单链RNA病毒,能够侵染烟草、辣椒和番茄等茄科植物,并造成严重经济损失,我国四川、贵州、湖南等辣椒产区已有报道,云南烟草产区2010年也发现了该... 详细信息

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinalmottle virus,ChiVMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的正单链RNA病毒,能够侵染烟草、辣椒和番茄等茄科植物,并造成严重经济损失,我国四川、贵州、湖南等辣椒产区已有报道,云南烟草产区2010年也发现了该病毒在烟草上零星为害。四川是我国烟草和辣椒的主产区之一,ChiVMV在烟草和辣椒之间可相互传播,加重了病害的发生和为害,给农业生产造成了严重经济损失。因此,研究不同作物上ChiVMV的生物学特性、基因组结构和功能,以及建立新的快速、灵敏、特异性强的检测方法,对于ChiVMV的防控具有重要理论和实践意义。本研究中,从中国四川西南部泸州地区感病烟草中分离得到ChiVMV-LZ,根据NCBI数据库中已报道ChiVMV的全基因序列设计引物,采用分段克隆法和RACE扩增法获得了ChiVMV-LZ基因组全序列。该序列全长为9 742nt,包含1个长9 270 nt的开放阅读框,编码1个长度为3 089 aa的多聚蛋白,具有马铃薯Y病毒属病毒的典型结构特点。利用DNAMAN和MEGAX等软件与GenBank上已经登陆的分离物序列进行序列比对与分析。结果显示ChiVMV-LZ与ChiVMV四川辣椒分离物ChiVMV-Yp8 （KC711055.1）的基因序列和氨基酸序列的同源性分别为98.76%和98.55%,亲缘关系最近,而与广东（KU987835.1）和海南（GQ981316.1）分离物亲缘关系较远。与云南烟草上的ChiVMV分离物（JX088636.1）同源性仅有83%,表明ChiVMV存在着遗传分化现象,并且具有一定的地理差异。与此同时,我们建立了一种新型恒温DNA扩增检测技术-重组酶聚合酶扩增（RPA）技术用于快速检测ChiVMV。结果表明,RPA法可在38℃条件下恒温反应30 min完成扩增反应,且与其他主要烟草病毒无交叉反应,特异性良好。灵敏度分析表明,RPA法的最低检测限度是普通PCR方法的10倍,灵敏度高。此外,该方法已成功应用于田间采集的烟草和辣椒的检测。本研究建立的RPA检测方法为在田间和基层实验室中快速检测ChiVMV提供了可靠、灵敏和有效的方法。

关键词：辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV) 系统发育分析重组酶聚合酶扩增(RPA)

来源： cnki会议评论

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甘肃农业大学学报 2024年

作者：卜沿宵张世杰张喜峰焦裕冰时桂芹李莹申莉莉杨金广袁莲莲李晓东郑州轻工业大学食品与生物工程学院中国农业科学院烟草研究所陕西省烟草公司宝鸡市公司青岛市农业技术推广中心

【目的】为筛选促生且生防效果优良的微生物应用于作物病毒病的绿色防控，开发一条安全的补硒途径用于富硒农产品生产。【方法】利用前期筛选的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis KBD-5经亚硒酸钠还原得到KBD-5-Se。通过... 详细信息

【目的】为筛选促生且生防效果优良的微生物应用于作物病毒病的绿色防控，开发一条安全的补硒途径用于富硒农产品生产。【方法】利用前期筛选的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis KBD-5经亚硒酸钠还原得到KBD-5-Se。通过病毒生物学测定和局部枯斑法，确定KBD-5和硒化后KBD-5-Se菌液对烟草花叶病毒（TMV）的体外钝化效率和体内抑制效率。通过将含有TMV的剪刀在KBD-5-Se发酵菌液中浸泡，检测KBD-5-Se发酵液对剪叶机械的消毒作用。通过菌液灌根和叶面喷施观察检测KBD-5-Se菌液对植物的促生和富硒农产品效果。【结果】KBD-5和KBD-5-Se发酵菌液对TMV的体外钝化效果分别达到94.59%和95.53%，且均可显著降低病毒CP基因相对表达量和CP蛋白相对表达量，防控效率分别达到78.27%和84.72%；使用经200倍稀释的KBD-5-Se发酵菌液浸泡1 min以上的剪刀处理叶片时，其对TMV的钝化效果高达100%。此外，KBD-5-Se发酵菌能够有效增加本氏烟的株高以及叶片的表面积。大棚试验结果表明经喷施KBD-5-Se菌液的番茄植株不仅产量有所提升，且番茄中硒含量也大幅提高。【结论】KBD-5-Se具有开发成为优良微生物消毒剂的潜质，可用于植物抗病促生及培育富硒农产品。

关键词：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌烟草花叶病毒纳米硒生物防治促生

内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

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植物病理学报 2018年第4期48卷 509-517页

作者：焦裕冰秦元霞何青云李方方申莉莉杨金广吴元华中国农业科学院烟草研究所青岛266101 沈阳农业大学沈阳110866

有研究表明烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染烟草能够激活转录因子Nb NAC089,从ER膜移至细胞核。为进一步阐释内质网应激因子Nb NAC089对病毒侵染胁迫的响应机制,利用CRISPR/Cas9... 详细信息

有研究表明烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染烟草能够激活转录因子Nb NAC089,从ER膜移至细胞核。为进一步阐释内质网应激因子Nb NAC089对病毒侵染胁迫的响应机制,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,经烟草遗传转染获得Nb NAC089基因突变植株。植株接种病毒后采用qRTPCR检测病毒CP基因和寄主UPR基因的表达。结果表明:CRISPR/Cas9系统定点敲除Nb NAC089基因后,目的基因靶位点序列有碱基的置换与缺失。正常生长条件下,转基因植株与野生型无差异。植株接种TMV-GFP后24~96 h,突变体中UPR基因(Bi P、b ZIP28、b ZIP60)的表达量显著高于野生型;接种TM V-GFP后2~6 d突变体中病毒的积累量和扩展速度显著高于野生型。表明Nb NAC089为UPR的抑制因子,对病毒增殖具有负调控作用。

关键词：转录因子NAC089 CRISPR/Cas9 病毒侵染内质网应激

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辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

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中国蔬菜 2023年第12期 42-48页

作者：邵煜尊张万红王惠王玉洁苗圃申莉莉李莹焦裕冰杨金广中国农业科学院烟草研究所烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室山东青岛266101 河南省烟草公司洛阳市公司河南洛阳471000

辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)是发生在辣椒上的一种重要病毒病。通过逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),以PMMo V外壳蛋白CP序列为靶标基因,设计F3/B3、FIP/BIP 4条引物,构建了基于RT-LAMP技术的PMMo V快速检测方... 详细信息

辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)是发生在辣椒上的一种重要病毒病。通过逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),以PMMo V外壳蛋白CP序列为靶标基因,设计F3/B3、FIP/BIP 4条引物,构建了基于RT-LAMP技术的PMMo V快速检测方法。结果表明,该方法在60 min内便可完成对PMMo V的特异性检测,灵敏度比传统RT-PCR技术高10倍,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应。本试验建立的PMMo V RT-LAMP检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可用于田间生产中对PMMo V的快速检测。

关键词：辣椒轻斑驳病毒 RT-LAMP检测快速检测

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防御假单胞菌KBD-3在作物病害防治及富硒中的应用研究

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作物杂志 2024年第6期 237-241页

作者：崔宏刘青赵秀珍宗浩李莹申莉莉焦裕冰王凤龙杨金广袁莲莲新泰市现代农业发展服务中心山东新泰271200 泰安市岱岳区农业技术推广中心山东新泰271000 东阿县农业技术推广中心山东东阿252201 山东临沂烟草有限公司山东临沂276000 中国农业科学院烟草研究所山东青岛266101

为筛选防效优良的微生物应用于作物病害防治中,同时开发一条安全的补硒途径进行富硒农产品的生产,对前期筛选到的防御假单胞菌KBD-3进行了抗病及纳米硒化研究。结果表明,KBD-3菌液对烟草花叶病毒具有较好的钝化效果,抑制率高达95.77%,... 详细信息

为筛选防效优良的微生物应用于作物病害防治中,同时开发一条安全的补硒途径进行富硒农产品的生产,对前期筛选到的防御假单胞菌KBD-3进行了抗病及纳米硒化研究。结果表明,KBD-3菌液对烟草花叶病毒具有较好的钝化效果,抑制率高达95.77%,同时对青枯雷尔氏菌的抑制效果较好,对烟草青枯病的相对防效达70.89%。另外,KBD-3可将亚硒酸钠还原为纳米硒,经纳米硒溶液处理的绿豆芽中硒含量大幅提高。这表明,KBD-3不仅为作物病害防治提供新的微生物资源,还能较好地用于作物的富硒培育。

关键词：防御假单胞菌病害防治富硒烟草花叶病毒青枯病绿豆芽

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纳米硒化荧光假单胞菌KBD-1菌株对烟草病毒病的抑制作用

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中国烟草科学 2021年第5期42卷 43-49页

作者：余婷婷袁莲莲李莹焦裕冰申莉莉王凤龙黄坤王勇李斌章松柏杨金广长江大学农学院湖北荆州434025 中国农业科学院烟草研究所青岛266101 云南省烟草公司红河州公司昆明650000 四川省烟草公司凉山州公司四川西昌615000 四川省烟草公司成都610000

为挖掘具有纳米硒化能力的生防菌株,开发烟草病毒病的绿色防治材料,从烟草病毒病重病田块健株根际土壤中筛选获得到一株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens KBD-1,对其进行了纳米硒化,采用Real-time PCR和Western blot测定了两者对烟... 详细信息

为挖掘具有纳米硒化能力的生防菌株,开发烟草病毒病的绿色防治材料,从烟草病毒病重病田块健株根际土壤中筛选获得到一株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens KBD-1,对其进行了纳米硒化,采用Real-time PCR和Western blot测定了两者对烟草常见病毒基因表达的影响,并采用接种法测定了其对烟株相应病毒病的防治作用。结果表明,纳米硒化后的KBD-1菌体外部存在高密度电子颗粒,在X射线11.22 keV处出现硒的特征吸收峰。纳米硒化后的*** KBD-1菌液浓度在5×10^(5) cfu/mL(单质硒浓度0.25 mg/L)时,对烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)4种病毒病的防治效果均在88.0%以上,对CMV防治效果最高达91.4%,该浓度处理对烟株促生效果显著。荧光假单胞菌KBD-1可成功将亚硒酸钠还原生成纳米硒,并能增强原始菌株的抗烟草病毒活性和促生效果。

关键词：纳米硒荧光假单胞菌烟草病毒病病毒抑制促生作用

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