四川烟草辣椒脉斑驳病毒的分离鉴定和RPA检测方法的建立
作者单位：沈阳农业大学植物保护学院
会议名称：《中国植物病理学会2019年学术年会》
会议日期：2019年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学]
基 金：四川省烟草公司计划管理类项目(2018-510500-2-4-024)
关 键 词：辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV) 系统发育分析 重组酶聚合酶扩增(RPA)
摘 要：辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinalmottle virus,ChiVMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的正单链RNA病毒,能够侵染烟草、辣椒和番茄等茄科植物,并造成严重经济损失,我国四川、贵州、湖南等辣椒产区已有报道,云南烟草产区2010年也发现了该病毒在烟草上零星为害。四川是我国烟草和辣椒的主产区之一,ChiVMV在烟草和辣椒之间可相互传播,加重了病害的发生和为害,给农业生产造成了严重经济损失。因此,研究不同作物上ChiVMV的生物学特性、基因组结构和功能,以及建立新的快速、灵敏、特异性强的检测方法,对于ChiVMV的防控具有重要理论和实践意义。本研究中,从中国四川西南部泸州地区感病烟草中分离得到ChiVMV-LZ,根据NCBI数据库中已报道ChiVMV的全基因序列设计引物,采用分段克隆法和RACE扩增法获得了ChiVMV-LZ基因组全序列。该序列全长为9 742nt,包含1个长9 270 nt的开放阅读框,编码1个长度为3 089 aa的多聚蛋白,具有马铃薯Y病毒属病毒的典型结构特点。利用DNAMAN和MEGAX等软件与GenBank上已经登陆的分离物序列进行序列比对与分析。结果显示ChiVMV-LZ与ChiVMV四川辣椒分离物ChiVMV-Yp8 （KC711055.1）的基因序列和氨基酸序列的同源性分别为98.76%和98.55%,亲缘关系最近,而与广东（KU987835.1）和海南（GQ981316.1）分离物亲缘关系较远。与云南烟草上的ChiVMV分离物（JX088636.1）同源性仅有83%,表明ChiVMV存在着遗传分化现象,并且具有一定的地理差异。与此同时,我们建立了一种新型恒温DNA扩增检测技术-重组酶聚合酶扩增（RPA）技术用于快速检测ChiVMV。结果表明,RPA法可在38℃条件下恒温反应30 min完成扩增反应,且与其他主要烟草病毒无交叉反应,特异性良好。灵敏度分析表明,RPA法的最低检测限度是普通PCR方法的10倍,灵敏度高。此外,该方法已成功应用于田间采集的烟草和辣椒的检测。本研究建立的RPA检测方法为在田间和基层实验室中快速检测ChiVMV提供了可靠、灵敏和有效的方法。