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罕见抗-Di^(b)致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

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中国输血杂志 2024年第2期37卷 158-164页

作者：廖志坚贾双双温机智莫春妍邵媛张润青罗广平姬艳丽广州血液中心临床输血研究所广州市血液安全重点实验室广东广州510095

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行... 详细信息

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行IgG分型检测,并用流式细胞术进行单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验,以检测抗体相关的吞噬率;对患儿母亲、父亲及舅舅进行相关红细胞血型基因测序;利用稀释的母亲血浆和抗人球卡法,在献血者中进行大规模相合血液的筛选。结果产妇鉴定为Di(b-)稀有血型,产生了抗-Di b(效价512)并导致了严重的HDFN;抗-Di b亚型分型为IgG1和IgG2型,单核细胞体外吞噬效率为88.83%(74.7/84.09);产妇亲属中没有相合献血者,后续从5520名献血者中筛选到2例Di(b-)相合血液,患儿接收输血治疗后康复出院。后续在51334名献血者中筛查到17名Di(b-)献血者,该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%,17/51334)。结论综合利用血型血清学及分子生物学方法诊断了抗-Di b所致的严重HDFN,建立了1种有效大规模筛查Di(b-)稀有血型的方法并找到相合血液,为建立Di(b-)稀有血型库奠定了基础。

关键词：抗-Di b Di(b-)稀有血型胎儿新生儿溶血病

结直肠癌中GINS复合物的表达及其临床意义

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结直肠癌中GINS复合物的表达及其临床意义

作者：温机智中山大学

学位级别：硕士

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。虽然以手术和细胞毒药物联合生物靶向治疗的多学科治疗方案使结直肠癌的治疗效果取得了一定的提高，但结直肠癌的治疗仍然面临巨大挑战。相关研究资料表明近三十年来结直肠癌治疗效果的提高并不明显，... 详细信息

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。虽然以手术和细胞毒药物联合生物靶向治疗的多学科治疗方案使结直肠癌的治疗效果取得了一定的提高，但结直肠癌的治疗仍然面临巨大挑战。相关研究资料表明近三十年来结直肠癌治疗效果的提高并不明显，最近大宗病例报告的结肠癌和直肠癌的术后5年生存率仍徘徊在70％和50％左右。目前，对于判断结直肠癌患者预后和选择治疗方法主要依靠TNM分期和其它一些病理指标，但临床上同一TNM分期、病理类型的结直肠癌患者，使用相同的治疗方案，疗效却不尽相同。TNM分期与病理诊断等传统的预测结直肠癌患者预后的方法并不能充分满足临床的要求，因此：目前迫切需要能够有效预测结直肠癌预后的生物分子标志物来优化结直肠癌治疗方案，实现结直肠癌的个体化治疗，进一步提高结直肠癌的治疗效果。 GINS复合物是一个由PSF1、PSF2、PSF3和SLD5四个基因编码的异四倍体复合物，在核酸复制的起始和延伸阶段发挥重要作用。近年来国外研究发现GINS复合物在多种恶性肿瘤中表达上调，且GINS复合物表达与肿瘤的发生发展、预后密切相关，可作为预测肿瘤患者预后的分子标志物，并有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。目前结直肠癌中GINS复合物各基因的表达及其临床意义尚未见报道。本研究运用实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌组织和相匹配的正常黏膜组织中GINS复合物四个基因的表达水平，并分析其与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系，探讨GINS复合物作为预测结直肠癌预后分子指标的可能性，以期辅助结直肠癌的病理诊断并为其预后判断、治疗方案的选择提供了更全面的依据。进一步地，采用RNA干扰技术抑制人结肠癌细胞株LoVo、HT-29和HCT116中PSF1的表达，观察其对结肠癌细胞增殖的影响，并进一步探讨其可能的机制，为发现结肠癌基因治疗的新靶点提供理论依据。【目的】 1、探讨GINS复合物在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。 2、检测Sld配偶体1基因(PSF1)在结肠癌组织中的表达，探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。【方法】 1、运用实时荧光定量PCR方法，检测76例结直肠癌标本中GINS复合物四个基因PSF1、PSF2、PSF3和SLD5的mRNA表达量。 2、分析结直肠癌标本中GINS复合物四个基因PSF1、PSF2、PSF3和SLD5表达与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系。 3、采用Westernblot检测40例结肠癌标本中PSF1蛋白的表达水平。 4、应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染人结肠癌细胞株LoVo、HT-29和HCT116，WesternBlot法检测PSF1蛋白表达变化。 5、MTT法、软琼脂克隆形成实验检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、克隆形成能力的影响。 6、流式细胞术、荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞细胞周期以及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。【结果】 1、荧光定量PCR检测结果显示，结直肠癌组织中PSF1、PSF2、PSF3和SLD5mRNA的表达水平均显著高于正常结直肠黏膜组织，差异有统计学意义（P0.05）;SLD5mRNA表达与淋巴结转移（P<0.01）有关。PSF1、PSF2和SLD5高表达组患者的5年生存率均明显低于低表达组（P<0.05），多因素分析结果显示：PSF1mRNA表达（P<0.05）是影响结直肠癌患者预后的独立因素之一。 3、Westernblot检测结果显示：结肠癌组织中PSF1蛋白的表达量为0.485±0.113，显著高于正常黏膜组织的0.056±0.014，差异有统计学意义（P<0.01）。 4、Westernblot检测结果显示：转染PSF1shRNA干扰质粒后，LoVo、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05)，可见转染PSF1shRNA干扰质粒可有效抑制结肠癌细胞中PSF1蛋白表达。 5、MTT法、软琼脂克隆形成实验结果显示：转染PSF1shRNA干扰质粒后，LoVo、HT-29和HCT116细胞增殖能力显著降低，克隆形成率明显下降，与阴性对照组及正常生长组细胞比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 6、流式细胞术、荧光定量PCR检测结果显示：转染PSF1shRNA干扰质粒后，LoVo、HT-29和HCT116细胞中S期细胞比例均明显增加，PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降，差异具有统计学意义(P＜0

关键词：结直肠肿瘤实时荧光定量PCR 预后 GINS复合物 PSF1 RNA干扰细胞增殖

PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

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中华胃肠外科杂志 2013年第1期16卷 70-74页

作者：温机智韩晓燕魏波张实卫洪波中山大学附属第三医院胃肠外科广州510630 中山大学附属第三医院中心实验室广州510630

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达，探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平；应用脂质体法将靶... 详细信息

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达，探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平；应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116，Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113，显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后，LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05），细胞增殖能力显著降低，软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。

关键词：结肠肿瘤基因,PSF1 RNA干扰细胞增殖

RUNX3抑癌基因真核表达载体的构建以及在膀胱癌T24细胞中的表达

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第A03期30卷 64-67页

作者：温机灵周祥福温机智同济大学附属东方医院泌尿外科上海200120 中山大学附属第三医院泌尿外科广东广州510630 中山大学附属第三医院中心实验室广东广州510630

【目的】构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并在膀胱癌T24细胞株中表达。【方法】RT-PCR从人正常膀胱组织中获取RUNX3基因并测序,将RUNX3基因克隆进pIRES2-EGFP载体,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并进行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切验证... 详细信息

【目的】构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并在膀胱癌T24细胞株中表达。【方法】RT-PCR从人正常膀胱组织中获取RUNX3基因并测序,将RUNX3基因克隆进pIRES2-EGFP载体,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并进行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切验证。脂质体介导下转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。【结果】成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,用脂质体转染人膀胱癌T24细胞后,在荧光显微镜下观察到带绿色荧光的人膀胱癌T24细胞。【结论】成功构建RUNX3基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3并在膀胱癌T24细胞中表达,为进一步研究RUNX3与膀胱癌的关系奠定基础。

关键词： RUNX3基因 T24细胞膀胱肿瘤

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结直肠癌组织中GINS复合物的表达及其临床意义

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中华胃肠外科杂志 2011年第6期14卷 443-447页

作者：卫洪波温机智魏波韩晓燕张实中山大学附属第三医院胃肠外科广州510630 中山大学附属第三医院中心实验室广州510630

目的探讨GINS复合物在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法运用实时荧光定量PCR方法检测76例结直肠癌标本中GINS复合物4个基因PSF1、PS砣、PSF3和SLD5的mRNA表达情况．并分析其与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系。结果结直肠... 详细信息

目的探讨GINS复合物在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法运用实时荧光定量PCR方法检测76例结直肠癌标本中GINS复合物4个基因PSF1、PS砣、PSF3和SLD5的mRNA表达情况．并分析其与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系。结果结直肠癌组织中PSF1、PSF2、PSF3和SLD5mRNA的相对表达量（0．001853±0．000651、0．007757±0．004260、0．000967±0．000481、0．003248±0．001721）均明显高于正常黏膜组织（0．000352±0．000169、0．002951±0．001216、0．000472±0．000271和0．001675±0．001156）（均P〈0．01）。PSF1mRNA表达与肿瘤大小（p〈0．01）有关；PSF2mRNA表达与患者年龄（P〈O．05）和淋巴结转移（P〈0．05）有关；PSF3mRNA表达与患者临床病理特征无关（P〉0．05）；SLD5mRNA表达与患者淋巴结转移（P〈0．01）有关。PSFl、PSF2和SLD5高表达组患者的5年生存率分别为57．1％、54．3％和54．3％，均明显低于低表达组患者的77．1％、80．O％和80．0％，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。Cox回归分析结果提示，PSFlmRNA表达是影响结直肠癌患者预后的独立因素之一（P〈0．05）。结论GINS复合物在结直肠癌组织中高表达，且与患者临床病理特征有密切关系．其中PSFlmRNA表达可作为预测结直肠癌患者预后的生物学指标。

关键词：结直肠肿瘤 GINS复合物预后实时荧光定量PCR

中国人群中RHAG变异对mRNA剪接影响的体外研究

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中国输血杂志 2023年第11期36卷 986-990页

作者：贾双双孙明明温机智魏玲罗广平姬艳丽广州血液中心广州市血液安全重点实验室广东广州510095 广州金域医学检验中心有限公司

目的通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响。方法通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择10种中国人群中分布频率相对较高的... 详细信息

目的通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响。方法通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择10种中国人群中分布频率相对较高的位于RHAG基因剪接位点附近的突变或编码区域的同义突变,构建相应的RHAG外显子野生型及突变型pSplicePOLR2G微基因表达质粒。转染HEK-293T细胞,48 h后收集细胞提取总RNA,反转录后进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测,根据实验结果判断RHAG基因突变是否会影响相应外显子的正常剪接。结果2种RHAG基因剪接位点附近突变(c.158-5delT,c.807+3A>C)轻微减弱了原剪接位点的剪接效率,其余8种突变(c.312G>A,c.341+3G>A,c.609C>T,c.681G>A,c.861G>A,c.957T>A,c.984T>C和c.1139-7G>A)均不影响RHAG基因mRNA的剪接。结论RHAG基因在剪接方面比较保守,剪接位点附近突变及编码区同义突变较少会引起RHAG基因异常剪接。

关键词： RHAG突变体外微基因剪接系统剪接异常中国人群

DFR变异型孕妇血型鉴定及孕期监测策略探讨

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中国输血杂志 2022年第3期35卷 327-330页

作者：温机智贾双双陈景旺魏玲罗广平姬艳丽广州血液中心临床输血研究所广州广东510095 广州市血液安全重点实验室

目的对3例RhD变异型孕妇进行血型血清学和分子生物学鉴定,探讨其孕期监测策略。方法收集3例D变异型孕妇外周血标本,采用2种单克隆抗-D试剂进行RhD抗原鉴定,使用D-Screen试剂盒进行D抗原表位检测。提取基因组DNA,采用多重连接探针扩增技... 详细信息

目的对3例RhD变异型孕妇进行血型血清学和分子生物学鉴定,探讨其孕期监测策略。方法收集3例D变异型孕妇外周血标本,采用2种单克隆抗-D试剂进行RhD抗原鉴定,使用D-Screen试剂盒进行D抗原表位检测。提取基因组DNA,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)和序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)基因分型试剂盒检测RHD-CE-D杂交等位基因,使用Sanger测序法对RHD基因进行测序分析。结果D抗原表位检测结果提示这3例标本为DFR变异型标本,进一步分子生物学检测鉴定其基因型分别RHD*DFR2/01N.01(n=2)和RHD*DFR1/1227A(n=1)。结论基因型为RHD*DFR2/01N.01的2例DFR表型孕妇的孕期检测策略应参照D阴性孕妇进行;而携带RHD*1227A等位基因即“亚洲型”DEL等位基因的DFR表型孕妇建议按照“亚洲型”DEL孕妇进行孕期监测,即无需频繁筛查意外抗体,也不需要预防性注射抗-D免疫球蛋白。

关键词： DFR RHD-CE-D杂交等位基因 D变异型 Rh血型系统

重组人IL1-Ra与TGF-β1共转染软骨细胞的基因表达

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中国临床解剖学杂志 2008年第2期26卷 179-181页

作者：张平蔡道章刘斌温机智曾春侯雪瑞张富程陆慧婷中山大学附属第三医院骨外科中山大学附属第三医院中心实验室广州510630

目的:探讨重组人IL1-Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞的表达情况。方法:体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的IL1-Ra与TGF-β1质粒通过脂质体介导下共转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果:荧光... 详细信息

目的:探讨重组人IL1-Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞的表达情况。方法:体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的IL1-Ra与TGF-β1质粒通过脂质体介导下共转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果:荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞中转基因得到表达。结论:IL1-Ra与TGF-β1基因共转染软骨细胞可以获得表达,为基因治疗骨关节炎的研究提供基础。

关键词： IL-1Ra 转化生长因子-β1 基因转染软骨细胞

广州地区汉族人群Diego血型系统多态性调查

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中国输血杂志 2015年第6期28卷 663-665页

作者：温机智付涌水罗广平魏玲王贞赵阳骆宏莫春妍张润青姬艳丽广州血液中心临床输血研究所广东广州510095

目的了解广州地区汉族人群中Diego血型系统DI1(Dia)和DI2(Dib)、DI3(Wra)和DI4(Wrb)两对抗原的基因频率分布,为指导临床输血提供依据。方法随机收集广州地区献血者200名,从静脉血提取基因组DNA。采用红细胞血型系统多重连接依赖的探针扩... 详细信息

目的了解广州地区汉族人群中Diego血型系统DI1(Dia)和DI2(Dib)、DI3(Wra)和DI4(Wrb)两对抗原的基因频率分布,为指导临床输血提供依据。方法随机收集广州地区献血者200名,从静脉血提取基因组DNA。采用红细胞血型系统多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术对DI1和DI2、DI3和DI4两对抗原进行基因分型。采用测序法对MLPA基因分型结果做进一步确认。结果广州地区汉族人群中DI1、DI2、DI3和DI4抗原的基因频率分别为0.040 0、0.960 0、0.000 0和1.000 0。MLPA基因分型结果与测序法分型结果完全一致。DI1和DI2、DI3和DI4抗原在广州地区汉族人群随机输血中抗原不配合率分别为3.84%和0.00%。结论 DI1和DI2抗原在广州地区汉族人群随机输血中不配合率较高,具有一定临床意义。通过MLPA方法可以对DI1和DI2抗原进行基因分型从而推测其表型,解决了因抗体来源困难导致抗原鉴定难以开展的难题。

关键词： Diego血型多重连接依赖的探针扩增技术基因测序基因频率