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犬瘟热病毒检测技术研究进展

特产研究 2024年

作者：刘雅坤王晓蕾杨斐斐毕振威赵建军山东威海市荣成市城西畜牧兽医站兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室黑龙江八一农垦大学动物科技学院山东烟台市福山区动物卫生监督所

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）感染引起的一种热性、高度接触性传染病。CDV可感染犬科、鼬科等十几个科属的多种动物，动物感染率和死亡率为30%～80%。CD易与其它病原混合感染从而导致... 详细信息

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）感染引起的一种热性、高度接触性传染病。CDV可感染犬科、鼬科等十几个科属的多种动物，动物感染率和死亡率为30%～80%。CD易与其它病原混合感染从而导致动物机体表现为复杂的临床症状。因此，准确、快速检测CDV感染是有效防控疫病传播的关键。本文概述了当前CDV检测技术的研究进展，主要包括CDV的病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测和其它新型检测技术，并对不同检测技术优缺点进行比较，为CD的诊断提供参考。

关键词：犬瘟热病毒检测技术免疫学分子生物学研究进展

猫冠状病毒和猫细小病毒双重荧光定量PCR方法的建立

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中国动物检疫 2024年第4期41卷 91-95页

作者：郭存杰王蕾毕振威钱晶张传美谭业平青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 南通伊仕生物技术股份有限公司江苏南通226010

为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性... 详细信息

为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性和重复性试验,探讨所建方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FCoV和FPV,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫轮状病毒、支原体、衣原体、波氏杆菌、犬腺病毒和犬副流感病毒等病原核酸无交叉反应,对FCoV和FPV检测限均为1 copies/μL;FCoV和FPV阳性参考质粒组间和组内重复试验变异系数均小于3%;对35份临床样本进行检测,发现建立的双重荧光定量PCR方法阳性检出率比普通PCR方法高。结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有灵敏、特异和稳定等优点,可用于临床FCoV和FPV感染的早期鉴别诊断。

关键词：猫冠状病毒猫细小病毒双重荧光定量PCR

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犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

中国兽药杂志 2024年第5期58卷 10-16页

作者：王卓徐司雨夏兴霞李志敏毕振威钱晶莫菲诸玉梅王永山孙树民谭业平内蒙古民族大学内蒙古通辽028000 江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9... 详细信息

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。

关键词：犬 PD-1 单克隆抗体肿瘤

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联合策略优化犬α干扰素的酵母表达

中国生物工程杂志 2022年第1期42卷 88-95页

作者：李丁李兰安允飞毕振威于晓明陈瑾郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所南京210014 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地南京210014 南京农业大学食品科技学院南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所南京210014

前期研究在毕赤酵母中分泌表达了犬α干扰素(CaIFN),其活性较高但产量未达到理想水平。目前工作的重点是提高重组蛋白产量。构建含有1、2、4、6、8拷贝CaIFN基因的酵母转化子,其中KM-6CaIFN产量最高,与KM-1CaIFN相比提高了200.6%。共表... 详细信息

前期研究在毕赤酵母中分泌表达了犬α干扰素(CaIFN),其活性较高但产量未达到理想水平。目前工作的重点是提高重组蛋白产量。构建含有1、2、4、6、8拷贝CaIFN基因的酵母转化子,其中KM-6CaIFN产量最高,与KM-1CaIFN相比提高了200.6%。共表达8种分子伴侣,其中Hac蛋白能够提高KM-6CaIFN和KM-8CaIFN的目的蛋白产量,提高幅度分别为32.1%和113.1%。在此基础上继续增加CaIFN拷贝数,可观察到KM-12CaIFN-Hac的产量最高,是KM-8CaIFN-Hac的1.33倍,同时是KM-1CaIFN的5.61倍。通过与梯度稀释的BSA进行蛋白质条带比较,评估KM-12CaIFN-Hac的靶蛋白产量约为581 mg/L,为目前报道中酵母产犬α干扰素最高值。

关键词：犬α干扰素毕赤酵母重组蛋白产量多拷贝分子伴侣

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犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其应用

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其应用

作者：毕振威南京农业大学

学位级别：硕士

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种高度接触性、致死性传染病。该病传染性强、发病率和死亡率高,并可引起机体免疫抑制,已成为养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护业危害最严重的传染病之一。因此,建立一种快速、特异的检测方... 详细信息

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种高度接触性、致死性传染病。该病传染性强、发病率和死亡率高,并可引起机体免疫抑制,已成为养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护业危害最严重的传染病之一。因此,建立一种快速、特异的检测方法对该病的防控十分重要。本研究旨在制备CDV特异性单克隆抗体,建立基于单克隆抗体的CDV检测方法,同时选择具有中和活性的单克隆抗体制备CD单克隆抗体治疗剂。试验内容包括：实验1：犬瘟热病毒的分离及其核衣壳蛋白基因序列分析从非典型犬瘟热(CD)病犬的肺和肝脏组织中分离犬瘟热病毒(CDV),用RT-PCR方法扩增核衣壳蛋白(N)基因,进行克隆和序列分析。结果表明：该CDV分离株N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%-97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,该CDV分离株与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。将N基因插入到原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达质粒pET-N,在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62kDa,主要以包涵体的形式存在;用Western blotting分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应。实验2：分泌犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立用纯化的犬瘟热病毒(CDV)免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选和克隆化,获得5株能稳定分泌CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H11、1D7、2C9、1F8和3G3,抗体亚类分别为IgG2bκ、IgG1κ、IgG2bκ、 IgG1κ和IgGlκ,诱生腹水的抗体效价分别为109、107、106、107和106。细胞染色体分析表明,5株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,高于SP2/0骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数;间接免疫荧光试验(IFA)证明,5株单抗均与CDV发生特异性反应;免疫印迹(western blotting)分析,单抗1F8和3G3能特异地识别CDV的N蛋白;在病毒中和试验中,单抗3H11和1D7的病毒中和效价分别为105和106,其它3株单抗则没有中和活性;经ELISA相加试验证实,5株单抗作用的抗原位点不同。实验3：犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立用纯化的犬瘟热病毒(CDV)单克隆抗体1D7作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体1F8作为检测抗体,建立检测CDV的单克隆抗体夹心ELISA方法。优化的试验反应条件为：单克隆抗体1D7的包被浓度为2μg/mL,用10%小牛血清封闭,酶标单克隆抗体1F8的稀释度为1：4000。特异性试验证明,单克隆抗体夹心ELISA方法与犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)和犬冠状病毒(CCV)无交叉反应;敏感性试验显示,该方法检测CDV病毒量的最低限为102TCID50/mL;重复性试验表明,夹心ELISA方法批内、批间变异系数小于5%。该单克隆抗体夹心ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于犬瘟热病毒(CDV)的临床检测。实验4：犬瘟热病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的制备用胶体金标记纯化的单克隆抗体1F8,捕获CDV抗原,将纯化的单克隆抗体1D7和羊抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜(NC膜),分别作为检测线和对照线,制备犬瘟热病毒胶体金免疫层析检测试纸条。优化的试验反应条件为：胶体金标记抗体的最适pH值为8.0,被标记单克隆抗体1F8浓度为18μg/mL,包被于NC膜的抗体1D7和羊抗鼠IgG抗体的浓度分别为1.4mg/mL和2.0mg/mL。用该试纸条可特异地检测犬瘟热病毒,检测CDV病毒量的最低限为103TCID50/mL,与相同单克隆抗体1D7和1F8建立的犬瘟热病毒夹心ELISA检测方法的敏感度相当,在1～5min内可得出检测结果,试纸条简便快速,便于犬瘟热的临床快速诊断。实验5：犬瘟热单克隆抗体治疗剂的制备用病毒中和试验测定5株单克隆抗体的中和活性,3H11和1D7两株单克隆抗体腹水的中和效价分别为105和106。选用中和效价高的1D7单克隆抗体杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,制备犬瘟热单克隆抗体治疗剂。该治疗剂对临床犬瘟热病犬有显著的治疗效果。

关键词：犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA 胶体金免疫层析试纸条生物制品

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人际关系视角下的送礼行为研究

人际关系视角下的送礼行为研究

作者：毕振威中北大学

学位级别：硕士

随着社会的飞速发展，人与人之间的交往更加频繁，送礼行为在人际交往的过程中将会起到越来越重要的作用。而目前对人际关系研究的文献很多，对送礼行为研究的也有一定的文献，但结合人际关系和送礼行为两方面进行研究的文献还不多见。... 详细信息

随着社会的飞速发展，人与人之间的交往更加频繁，送礼行为在人际交往的过程中将会起到越来越重要的作用。而目前对人际关系研究的文献很多，对送礼行为研究的也有一定的文献，但结合人际关系和送礼行为两方面进行研究的文献还不多见。而中华民族受到儒家思想的影响长达两千多年，铸就了中国人“礼尚往来”的性格。因此从人际关系的视角下来研究送礼行为就显得尤为重要。本文运用理论研究和实证研究相结合的方法，以人际关系理论与送礼行为理论为指导，系统地分析了人际关系的构成以及送礼行为的影响因素。据此构建了人际关系影响送礼行为过程的概念模型。在文献综述的基础上，结合调查问卷，对460名消费者进行了调查，并运用SPSS软件和Lisrel软件等数据工具对354份有效问卷中的数据进行了分析和验证。本文首先介绍了人际关系的相关理论以及人际关系的分类;其次对影响送礼行为的主要因素进行了归纳。在文中把人际关系分为血缘关系、业缘关系和地缘关系三种关系类型。而送礼行为的影响因素从质量、信息、价格、品牌和时间五个维度来衡量。第三，深入探究了不同人际关系背景下对送礼行为的影响机理，并提出假设构建出结构模型;第四，采取问卷调查的方式收集一手数据，运用SPSS软件和Lisrel软件对模型加以验证，并针对结论提出营销建议。研究发现，血缘关系对质量、信息、价格、品牌以及时间都具有积极影响，业缘关系对信息、品牌和价格具有积极影响，地缘关系对信息、品牌和价格具有积极影响，这种差异落实在消费者身上可以概括为：为了加强或者维系感情会以实用性为标准表达真情，主要体现在对质量的关注，也反映在对品牌和价格的折中，往往以低价格来换取最大的面子，在人际关系中的血缘关系体现的尤为明显;而为了得到自身的利益达到“资源交换”的目的，更多体现在对品牌档次的追捧，以求用较高的价格来得到最大的回报，这在业缘关系中表现的尤为突出。地缘关系对时间影响不明显，说明地缘关系对时间影响不敏感;地缘关系对质量具有显著影响但是并非正向影响，业缘关系对时间具有显著影响但是并非正向影响，这些现象说明，质量除了受地缘关系的影响还受其他因素的影响，时间除了受业缘关系的影响也受到了其他因素的影响，造成这种结果的原因是血缘关系、业缘关系和地缘关系不会完全独立，它们往往有重合的部分，这有待其他学者进行更进一步的研究，在本文中不做细致分析。

关键词：人际关系送礼行为因子分析结构方程

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网络分析法在物流服务供应商选择中的应用

电子世界 2012年第17期 88-89页

作者：毕振威中北大学经济与管理学院

文章阐述了网络分析法(ANP)的原理,对物流服务供应商选择提出了一个综合方法。供应商选择的相关指标已被证实和应用于构建ANP模型。ANP在供应商最终选择中的应用已通过案例验证。从用科学规则评估供应商的基础上,ANP应用于建立依赖反馈... 详细信息

文章阐述了网络分析法(ANP)的原理,对物流服务供应商选择提出了一个综合方法。供应商选择的相关指标已被证实和应用于构建ANP模型。ANP在供应商最终选择中的应用已通过案例验证。从用科学规则评估供应商的基础上,ANP应用于建立依赖反馈网络来选择物流服务供应商。这种方法能使设计者更好的理解设计过程中相关因素之间的复杂关系,进而增加设计的可信性。

关键词：物流服务供应商网络分析法超矩阵

免疫鸭体内副黏病毒的分离及其F基因的分子特征

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中国兽医学报 2013年第4期33卷 493-499页

作者：杨建朋毕振威欧阳伟王永山刁有祥山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为分析当地鸭副黏病毒流行状况及其融合蛋白(F)基因的序列特征,从江苏省某新城疫疫苗免疫过的鸭群中分离到1株病毒,经血清学试验和中和试验鉴定为鸭副黏病毒,命名为JS0920株。生物学特性分析,9日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5.3;... 详细信息

为分析当地鸭副黏病毒流行状况及其融合蛋白(F)基因的序列特征,从江苏省某新城疫疫苗免疫过的鸭群中分离到1株病毒,经血清学试验和中和试验鉴定为鸭副黏病毒,命名为JS0920株。生物学特性分析,9日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5.3;9日龄SPF鸡胚的最小致死量平均死亡时间(MDT)为47.7h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.875,6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定为2.7。用该病毒的培养物(鸡胚尿囊液)经肌肉注射攻毒,鸭的发病率为70%,死亡率为40%;鸡的发病率和死亡率均为100%。用RT-PCR方法扩增该分离毒株的F基因,序列分析表明,JS0920株与标准强毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与免疫预防用的LaSota株的同源性分别为89.0%和92.2%;其多肽裂解位点为112R-R-Q-R-R-F117,具有高致病性鸭副黏病毒毒株的分子特征;系统发育进化树分析,JS0920株与LaSota株的基因型不同,JS0920株为基因IX型,与F48E9株的亲缘关系最近。试验结果对认识当前DPMV的流行和变异现状以及疫苗研制具有重要的参考价值。

关键词：鸭副黏病毒 F基因基因IX型分子特征

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断奶仔猪胃肠道乳酸菌及芽孢杆菌的分离鉴定

中国兽医科学 2011年第12期41卷 1228-1233页

作者：朱小翠王晓丽王永山毕振威王冉范红结江苏省农业科学院兽医研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院食品质量安全检测研究所江苏南京210014

为研制优良的猪用益生菌制剂,从断奶仔猪胃肠道分离乳酸菌和芽孢杆菌,结合细菌的形态特征、生理生化指标,运用16SrRNA基因序列分析方法对其进行了鉴定。结果表明,分离株WR、KR、HR、JR分别为胃、空肠、回肠、结肠源的唾液乳杆菌(Lactoba... 详细信息

为研制优良的猪用益生菌制剂,从断奶仔猪胃肠道分离乳酸菌和芽孢杆菌,结合细菌的形态特征、生理生化指标,运用16SrRNA基因序列分析方法对其进行了鉴定。结果表明,分离株WR、KR、HR、JR分别为胃、空肠、回肠、结肠源的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius);ZR株为直肠源的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii);MR株为盲肠源的粪肠球菌(Enterococcus faecalis);分离株WY、SY、KY分别为胃、十二指肠、空肠源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);HY株为回肠源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cere-us)。各分离株的生长曲线有明显差异,HR、ZR和WY株的生长速度较快,分别于接种后第12、12和20小时达到生长高峰期,显示了良好的培养特性。

关键词：乳酸菌芽孢杆菌断奶仔猪分离鉴定