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猪斯钙素-1基因对线粒体功能的影响及其信号通路相关基因在不同体型猪表达模式检测

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猪斯钙素-1基因对线粒体功能的影响及其信号通路相关基因在不同体...

作者：杨开典扬州大学

学位级别：硕士

斯钙素(Stanniocalcin,STC)是最早在鱼类中发现一种糖蛋白激素,起调节钙/磷平衡的作用。血清钙升高可以引起斯钙尼氏小体释放STC-1,钙离子流通过鱼鳃、肠来保持血液中钙离子浓度的稳定。近年来在人和其它哺乳动物中也发现STC,先后分别... 详细信息

斯钙素(Stanniocalcin,STC)是最早在鱼类中发现一种糖蛋白激素,起调节钙/磷平衡的作用。血清钙升高可以引起斯钙尼氏小体释放STC-1,钙离子流通过鱼鳃、肠来保持血液中钙离子浓度的稳定。近年来在人和其它哺乳动物中也发现STC,先后分别命名为STC-1和STC-2。这两种基因在大部分组织中广泛表达,它们主要通过自分泌/旁分泌方式来调节动物机体多个生理功能,其中STC-1基因主要功能是通过调控钙/磷平衡、调控体内骨代谢以及通过线粒体中解偶联蛋白阻碍三磷酸腺苷酸(ATP)正常产生,从而影响生长发育。本研究通过构建STC-1基因过表达载体和设计合成的STC-1 siRNA载体分别上调和下调STC-1基因的表达,在细胞水平上检测STC-1基因对线粒体功能的影响。通过巴马猪和大白猪两种不同体型猪中STC-1基因及其与细胞代谢、生长发育相关基因表达水平分析,研究这些基因的表达特征。通过对上述基因生理功能和其调控机制的分析以及鉴定影响猪体型发育的新通路,为初步阐明不同体型猪发育差异的遗传学机制提供了理论基础。主要研究内容和结果如下:1.猪STC-1基因对细胞线粒体功能的影响本研究根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计了 3对小干扰RNA(Smallinterfering RNA;siRNA)、阴性对照siRNA。转染PK15细胞(猪肾细胞)后,通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率和基因表达效率,利用QRT-PCR与Western-blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1 siRNA表达水平与STC-1蛋白的表达量。结果表明,成功设计了猪STC-1 siRNA引物序列,在细胞水平对该基因沉默效率进行了检测,证明设计的STC-1 siRNA均能对STC-1进行基因沉默,其中STC1-132基因沉默效率最好。将筛选出的STC-1 siRNA沉默效果好的基因(siSTC组)与构建的STC-1基因过表达载体(STC组)转染PK15细胞后,通过Westernblot分别检测STC组与siSTC组的STC-1蛋白、线粒体相关蛋白及乙酰化的表达量。结果显示,STC-1基因过表达或沉默能显著上调或下调PMP70、OPA、DRP、mfn的表达水平。利用流式细胞仪分别检测各组细胞凋亡、线粒体膜电位、活性氧(ROS)、ATP等相关理化指标,以及用透射电镜观察各组细胞线粒体结构和形态的变化。结果显示,STC-1基因过表达和基因沉默后都可以降低细胞凋亡率和活性氧生成,显著提高细胞膜电位,大幅度降低细胞内ATP的生成,同时也可影响线粒体的形态结构和数量。说明STC-1基因表达水平的变化和线粒体功能密切相关,该基因在维持线粒体正常功能方面可能发挥一定的作用。2.猪STC-1基因及其信号通路相关蛋白在不同体型猪中表达模式检测本研究分别采集巴马猪和大白猪的肺脏、肾脏、软骨、肝脏、脾脏、肌肉、心脏等组织,运用Western blot分别对大小体型猪中多组织的STC-1蛋白与线粒体融合蛋白OPA、Mfn、DRP以及线粒体能量代谢蛋白PMP70表达进行检测。并对STC-1基因进行表观遗传学检测。结果表明,大小体型猪多组织尤其是骨骼肌、心肌及软骨组织中的STC-1蛋白与线粒体融合蛋白OPA、Mfn、DRP以及线粒体能量代谢蛋白PMP70的表达有显著差异。上述蛋白在巴马猪多组织中显著高于大白猪,初步说明STC-1基因及其信号通路基因可能与猪的体型发育有一定关联。

关键词：猪斯钙素体型线粒体

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肉鸡鼻气管炎鸟杆菌的分离与鉴定

中国兽医科学 2016年第9期46卷 1135-1140页

作者：薛营杨开典林伟东陆玮徐建生扬州大学兽医学院江苏扬州225009

从江苏省某白羽肉鸡场出现呼吸道症状的鸡群中分离获得1株病原菌,并对该病原菌进行PCR鉴定。将分离菌株纯化后电镜观察,生化试验检测其生化特性。结果显示,该分离菌株为鼻气管炎鸟杆菌,未发现有菌毛、鞭毛、芽胞等细菌的特殊结构。生化... 详细信息

从江苏省某白羽肉鸡场出现呼吸道症状的鸡群中分离获得1株病原菌,并对该病原菌进行PCR鉴定。将分离菌株纯化后电镜观察,生化试验检测其生化特性。结果显示,该分离菌株为鼻气管炎鸟杆菌,未发现有菌毛、鞭毛、芽胞等细菌的特殊结构。生化试验结果显示,硝酸盐反应和吲哚试验均为阴性,氧化酶、β-半乳糖苷酶、尿素酶反应均为阳性。

关键词：鼻气管炎鸟杆菌分离鉴定 PCR 电镜观察生化试验

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试行投产项目跟踪法健全投资效益统计

中国统计 1987年第4期 41-42页

作者：杨开典厦门市统计局

固定资产投资效益统计应当反映投资和由投资而创造的成果之间的关系.固定资产投资效益不仅表现在投资过程中,而且表现在项目投入使用之后,一般表现为形成的新增固定资产、创造

关键词：投资财政管理固定资产投资效益新增生产能力工业生产能力跟踪法投产项目

猪STC-1 siRNA设计及其基因沉默效率检测

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2017年第1期38卷 16-19页

作者：杨开典陈偲齐传翔鞠辉明扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计3对小干扰RNA(siRNA)、阴性对照siRNA,转染PK15细胞后,通过荧光观察转染效率和基因表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1siRNA及蛋白的表达水平。结... 详细信息

根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计3对小干扰RNA(siRNA)、阴性对照siRNA,转染PK15细胞后,通过荧光观察转染效率和基因表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1siRNA及蛋白的表达水平。结果表明:3个STC-1siRNA转染细胞后均有较高的荧光信号;STC-132细胞组STC-1mRNA和STC-1蛋白相对表达水平都最低,该组与其他组差异极显著。结果说明成功设计出STC-1siRNA序列,为后续通过调控STC-1表达研究其在肌肉发育中的功能奠定了基础。

关键词：猪斯钙素 siRNA 基因沉默

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小鼠MSTN shRNA设计及其活性检测

扬州大学学报（农业与生命科学版） 2015年第3期36卷 5-8页

作者：祁钰钰杨跃飞杨开典鞠辉明扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

根据小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)mRNA序列设计4对shRNA序列,通过退火连接到shRNA过表达载体pGPU6/GFP/Neo,构建相应的过表达载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA。转染C2C12细胞后,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot试验对shRNA基因沉默后MSTN mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果表明:设计并构建的4个MSTN shRNA过表达载体,在细胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表达水平,其中转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714载体细胞组基因沉默效率最高,MSTN mRNA和蛋白表达分别下降72%、74%,差异极显著(P<0.01)。该研究成功设计了4个MSTN shRNA序列并构建了相应的高效表达载体,为后续通过调控MSTN表达研究其在肌肉发育中功能奠定基础。

关键词：小鼠肌肉生长抑制素 shRNA 基因沉默

STC-1基因在大、小体型猪中表达与分布的差异分析

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中国畜牧兽医 2017年第10期44卷 2845-2850页

作者：杨开典齐传翔祁钰钰鞠辉明扬州大学兽医学院、江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

试验分别采集40日龄小体型猪(巴马猪)和大体型猪(大白猪)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、头骨、骨骼肌组织,利用实时荧光定量PCR检测斯钙素-1(stanniocalcin 1,STC-1)基因mRNA在各个组织中的表达水平,并通过Western blotting检测STC-... 详细信息

试验分别采集40日龄小体型猪(巴马猪)和大体型猪(大白猪)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、头骨、骨骼肌组织,利用实时荧光定量PCR检测斯钙素-1(stanniocalcin 1,STC-1)基因mRNA在各个组织中的表达水平,并通过Western blotting检测STC-1蛋白在各个组织中的分布。实时荧光定量PCR检测结果表明,STC-1基因mRNA在巴马猪和大白猪肺脏、肾脏中相对表达水平较高,在骨骼肌中的表达水平最低;除心脏和骨骼肌外,巴马猪其余各组织中STC-1基因mRNA表达水平均显著高于大白猪(P<0.05)。Western blotting检测结果表明,巴马猪肝脏中STC-1蛋白的表达量最高,而大白猪脾脏中STC-1蛋白表达量最高,两者差异显著(P<0.05);巴马猪肺脏、肝脏、骨骼肌及心脏组织中STC-1蛋白表达量均极显著高于大白猪(P<0.01);而巴马猪肾脏、脾脏中STC-1蛋白表达量极显著低于大白猪(P<0.01)。本研究首次对大、小体型猪不同组织的STC-1基因mRNA表达水平及其STC-1蛋白分布进行检测,导致该基因表达与分布差异的原因可能与两种猪受外界环境应激及生长发育差异有关。

关键词：猪体型斯钙素-1(STC-1)基因表达与分布

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生长激素自分泌作用机制研究进展

动物医学进展 2016年第5期37卷 102-105页

作者：齐传翔杨开典祁钰钰鞠辉明扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

生长激素(growth hormone,GH)是由脑垂体前叶分泌的一种多肽激素,它作为一种特殊的生物活性蛋白促进机体合成代谢和蛋白质合成。GH传统的作用机制是垂体产生GH开始作用于膜受体,然后刺激肝脏胰岛素生长因子(insulin-like growth factor-... 详细信息

生长激素(growth hormone,GH)是由脑垂体前叶分泌的一种多肽激素,它作为一种特殊的生物活性蛋白促进机体合成代谢和蛋白质合成。GH传统的作用机制是垂体产生GH开始作用于膜受体,然后刺激肝脏胰岛素生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)生成,进而影响机体多个器官发育。近年的研究表明,GH除了内分泌作用途径,还可通过自分泌及旁分泌途径产生生物学效应。GH自分泌可以参与调控雄性和雌性动物生殖功能;GH自分泌对肌肉组织的代谢和生长也有重要影响,另外,GH自分泌与肿瘤的发生有密切的关系,其在一定程度上可以促进部分癌细胞的增殖,分化与迁移。通过对GH自分泌作用机制的研究有望发现自分泌GH在动物体内新的生物学作用,也有助于研究并治疗GH自分泌异常引发的相关疾病。

关键词：生长激素自分泌生殖肌肉发育致肿瘤

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斯钙素对哺乳动物生长发育的影响概述

动物医学进展 2015年第9期36卷 109-112页

作者：杨开典祁钰钰杨跃飞鞠辉明扬州大学兽医学院江苏扬州225000 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

斯钙素(STC)最早发现于鱼类,是一个作用于鱼鳃、小肠和肾脏,调节血清钙和磷酸盐(Pi)体内平衡的重要内分泌因子。哺乳动物中鉴定存在的STCs(STC-1和STC-2)基因几乎在所有组织中广泛表达,主要通过自分泌/旁分泌方式来调节动物机体多个生... 详细信息

斯钙素(STC)最早发现于鱼类,是一个作用于鱼鳃、小肠和肾脏,调节血清钙和磷酸盐(Pi)体内平衡的重要内分泌因子。哺乳动物中鉴定存在的STCs(STC-1和STC-2)基因几乎在所有组织中广泛表达,主要通过自分泌/旁分泌方式来调节动物机体多个生理功能。哺乳动物体内STCs在局部起到运输Ca2+和Pi的作用,可能通过作用钙离子通道和Na+/Pi共同的转运子产生生物学作用。通过对多个过表达STC基因的转基因小鼠及STC基因敲除小鼠品系研究果,发现STC对生长发育包括肌肉及骨骼发育有明显抑制作用。另外,STCs可以直接调控骨细胞增殖及分化,还参与调控线粒体、内质网胞浆等亚细胞功能,特别是通过调节线粒体中解偶联蛋白功能影响动物能量代谢,进而对动物的生长发育产生影响。论文总结了STCs在哺乳动物中相关信息,主要关注它们的来源、组织分布以及生长发育方面可能的调控机制,有助于了解和挖掘该基因在家畜中的生物学作用。

关键词：斯钙素生长发育骨代谢肌肉发育

小鼠MSTN shRNA可控表达载体构建及基因沉默效率研究

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2016年第4期37卷 1-4页

作者：杨跃飞祁钰钰杨开典齐传翔鞠辉明扬州大学兽医学院江苏扬州225009

肌肉生成抑制素(MSTN)是肌肉发育的负调控因子。根据MSTN mRNA序列设计1对MSTN shRNA并构建整合型四环素诱导表达MSTN shRNA载体pSingle-tTS-MSTN shRNA-GFP。重组载体转染小鼠成肌细胞并经G418筛选,通过强力霉素(DOX)诱导细胞中MSTN sh... 详细信息

肌肉生成抑制素(MSTN)是肌肉发育的负调控因子。根据MSTN mRNA序列设计1对MSTN shRNA并构建整合型四环素诱导表达MSTN shRNA载体pSingle-tTS-MSTN shRNA-GFP。重组载体转染小鼠成肌细胞并经G418筛选,通过强力霉素(DOX)诱导细胞中MSTN shRNA表达,利用荧光显微镜观察细胞中GFP表达情况,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot检测MSTN mRNA及蛋白的表达水平。结果表明:经DOX诱导后,转染含MSTN shRNA重组载体细胞组MSTN mRNA相对表达水平比未经DOX诱导组及其他对照组细胞中降低70%左右,差异极显著(P0.05)。该研究成功构建了可控表达MSTN shRNA载体,并在细胞水平证明其有很好的基因表达及调控效率,为后续制备可控表达MSTN shRNA转基因小鼠,通过精细调控MSTN基因的表达为研究该基因在肌肉发育中的功能奠定基础。

关键词：肌肉生成抑制素可控表达 shRNA 基因沉默