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绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的原核表达、生物信息学分析及鼠源多克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2024年

作者：邓博文刘晓艳王永飞靳玲李江斌哈尔勒哈·阿曼太蔡江李有文塔里木大学动物科学与技术学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技兵团重点实验室新疆生产建设兵团南疆动物疫病诊断与防控工程实验室新疆生产建设兵团农一师畜牧兽医工作站新疆焉耆回族自治县畜牧兽医局

为了解绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的免疫原性和生物学功能,并获得其鼠源多克隆抗体,试验先以绵羊肺炎支原体基因组DNA为模板,PCR扩增DnaJ基因,将该基因片段插入至原核表达载体pET-42b中构建重组质粒pET42bDnaJ,将重组质粒pET42b-DnaJ转化至... 详细信息

为了解绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的免疫原性和生物学功能,并获得其鼠源多克隆抗体,试验先以绵羊肺炎支原体基因组DNA为模板,PCR扩增DnaJ基因,将该基因片段插入至原核表达载体pET-42b中构建重组质粒pET42bDnaJ,将重组质粒pET42b-DnaJ转化至BL21(DE3)感受态细胞中,获得重组菌pET42b-DnaJ/BL21(DE3);然后用IPTG对重组菌进行诱导表达,对表达的重组蛋白进行可溶性分析、鉴定和纯化;随后采用生物信息学软件对绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白进行生物信息学分析(亲水性、跨膜区域、B细胞抗原表位、磷酸化位点、二级结构、三级结构、亚细胞定位预测);最后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并分别通过间接ELISA方法和Western-blot方法检测绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白鼠源多克隆抗体的效价和及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组表达菌在41.5 ku处出现目的条带,与预期大小相符,重组蛋白主要以包涵体形式表达;可与鼠抗His标签抗体特异性结合,纯化后重组蛋白在正确位置出现单一的特异性条带,质量浓度为0.24 mg/m L。经生物信息学分析,绵羊支原体DnaJ蛋白亲水性区域分布在第1～10,12～18,20～30,32～57,61～91,108～129,141～182,190～198,204～228,230～239,247～262,264～281,291～308,311～318,321～337,347～358,361～376位氨基酸位点;为膜外蛋白,无跨膜区域;存在13个B细胞抗原表位,分别分布在5～24,26,28,30～90,111～128,137～209,211～221,246～254,267～273,302～314,323～333,246～256,360～372位氨基酸位点;共存在67个磷酸化位点,其中包含35个丝氨酸位点、18个苏氨酸位点和14个酪氨酸位点;二级结构主要为无规则卷曲和α-螺旋,然后依次为延伸链、β-转角,参与这4种二级结构构成的氨基酸分别占氨基酸总量的48.40%、25.40%、19.79%、6.42%;预测的三级结构与二级结构结果一致;亚细胞定位于细胞质中。制备的绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白鼠源多克隆抗体效价为1∶12 800,能与重组蛋白特异性结合。说明绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的免疫原性,由其制备的鼠源多克隆抗体效价较高、特异性较好。

关键词：绵羊肺炎支原体 DnaJ 原核表达生物信息学多克隆抗体

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不同钙制剂处理对骏枣裂果的影响

不同钙制剂处理对骏枣裂果的影响

作者：李江斌塔里木大学

学位级别：硕士

近十几年来,规模化种植枣树后,枣树裂果现象一直困扰着果农,是迫切需要解决的一大难题。本文以兵团第一师阿拉尔市九团十二连的骏枣为供试材料,选用EDTA-Ca溶液、CaCl溶液两种钙制剂对骏枣进行喷施处理,分析外源钙与枣裂果的关系,为今... 详细信息

近十几年来,规模化种植枣树后,枣树裂果现象一直困扰着果农,是迫切需要解决的一大难题。本文以兵团第一师阿拉尔市九团十二连的骏枣为供试材料,选用EDTA-Ca溶液、CaCl溶液两种钙制剂对骏枣进行喷施处理,分析外源钙与枣裂果的关系,为今后有效控制果实裂果、提高果树抗裂能力提供参考和科学依据。主要研究结果如下:(1)通过田间观察发现,EDTA-Ca 1500倍液与CaCl400倍液处理分别较对照自然裂果率显著降低了14.01%、13.73%。室内诱裂试验表明,螯合钙EDTA-Ca 1500倍液处理下浸果裂果率、吸水率较对照分别降低了71.24%、35.51%。幼果期-白熟期施钙抗裂效果较其它时期处理效果影响最大。(2)果皮SOD、POD、CAT活性随果实成熟度的增加逐渐降低,施钙显著减缓了SOD、POD、CAT活性的下降;施用CaCl200倍液,CAT活性较对照显著提高,高钙处理对CAT活性有较强的响应趋势,施用CaCl较EDTA-Ca影响更大。螯合钙EDTA-Ca 1500倍液处理下,POD、SOD活性显著高于其它处理。(3)施钙后骏枣果皮中水溶性果胶含量较对照显著降低,离子结合果胶、共价结合果胶、纤维素含量较对照显著提高。随着果实接近成熟,果皮内部原果胶向水溶性果胶转化,纤维素逐渐被降解,施钙处理较对照水溶性果胶转化减缓,纤维素降解速率降低。螯合钙EDTA-Ca 1500倍液较其它处理减缓效果更佳,幼果期-白熟期喷施较其它时期喷施效果更好。随着果实不断成熟,施钙后果皮与对照相比可溶性糖、淀粉、蛋白质含量显著增加,外源钙改善了果实品质,增加蛋白质含量,提高果实抗性,促进果实渗透调节平衡。(4)施钙后骏枣果皮、果肉中Ca含量较对照显著增加,果皮中Ca含量显著高于果肉,幼果期-白熟期Ca含量最高,多次施钙积累对Ca吸收较单一时期效果显著,膨大期施钙较其它时期效果显著。施钙后果实中K、P、Fe、Zn、B含量较对照明显升高,果肉中K含量显著高于果皮,果皮中Fe、Zn、B含量显著高于果肉,Mg、P含量果实中差异较小;中后期高钙处理打破了果实中矿质元素平衡,K含量在果皮、果肉中均呈逐步降低趋势;P含量在白熟期、膨大期有较高的吸收转化效率,果肉P含量与对照呈显著差异。Mg含量增长趋势与施钙浓度相关,高钙下抑制Mg离子的吸收,低浓度促进吸收。适宜钙浓度可促使果实对Fe、Zn离子的吸收,幼果期-白熟期施钙吸收效率较其它时期效果高,与Ca吸收效果呈正相关关系。(5)施钙后蜡质层、角质层、表皮层厚度较对照呈上升趋势,角质层、表皮厚度较对照显著增加,与裂果率呈显著负相关。施钙后,角质层细胞排列均匀整齐;表皮层结构紧密,层数增加,形态整齐清晰;果肉组织细胞中空腔变小,分布均匀,结构规则。以螯合钙EDTA-Ca 1500倍液效果最好,施用时期效果最佳为幼果期-白熟期。

关键词：钙制剂骏枣裂果抗裂性生理特性

可溶性人PD-1蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响

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可溶性人PD-1蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响

作者：李江斌第四军医大学

学位级别：硕士

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种严重威胁人类健康和生命安全的恶性肿瘤,为全球常见肿瘤的第5位,其死亡率居恶性肿瘤的第3位[1],我国肝癌死亡率在城市仅次于肺癌,在农村则次于胃癌,其发病率逐年增高,每年全球HCC死亡率... 详细信息

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种严重威胁人类健康和生命安全的恶性肿瘤,为全球常见肿瘤的第5位,其死亡率居恶性肿瘤的第3位[1],我国肝癌死亡率在城市仅次于肺癌,在农村则次于胃癌,其发病率逐年增高,每年全球HCC死亡率高达50多万人,而新发病人数则达到60多万人,其中约50%发生于我国[2]。肝癌恶性程度高、预后差、病死率高,多数患者在经确诊时,已属于中晚期[3],由于患者的肝功差,且多伴有转移,仅10%-20%的患者可行姑息性手术切除,切术后5年生存率仅为25%-50%。因此,新的能够有效抑制肝癌细胞生长的方法将是目前研究的关键。随着对肿瘤免疫学的深入研究,证明了机体对肿瘤存在特异性免疫反应,这为肿瘤治疗指明了新方向,使免疫疗法成为肿瘤治疗的重要手段之一,其中以DC瘤苗为基础的生物免疫治疗成为近年来人们研究的热点,目前部分DC瘤苗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验[4]。树突状细胞(DC)作为目前已知的专职且功能最为强大的抗原递呈细胞(APC),参与抗原的捕捉、加工、处理和递呈,是淋巴细胞活化、增生、发挥效应的始动环节,主要参与细胞免疫和T细胞依赖的体液免疫,在抗肿瘤免疫应答中起关键作用[5]。体外和动物实验表明,以适当形式的肿瘤抗原负载DC制备瘤苗,可激活能够识别、杀伤肿瘤细胞的特异性T细胞,并可产生免疫记忆效应。大量的临床试验研究也表明DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗具有良好的应用前景[6]。在人体的抗肿瘤免疫机制中,T细胞介导的细胞免疫为主要方式。初始T细胞的活化需要两个信号,即由T细胞抗原受体(TCR)与DC上的抗原肽-MHC分子复合物结合提供的抗原特异性信号,又需要DC上的B7共刺激分子与T细胞上的CD28分子结合提供的共刺激信号[7]。只有双信号共同刺激才能有效激活T细胞反应,若缺乏第二信号刺激,将使T细胞处于克隆无能或无应答状态[8],因此B7/CD28共刺激信号对T细胞的活化起着至关重要的作用。近年来,PD-L1/PD-1作为B7/CD28协同刺激分子超家族的一个重要成员,其作用已被越来越多人重视[9]。PD-L1作为B7家族的一个新成员,主要表达于造血细胞,如静息的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞[10],其受体PD-1主要表达在活化的T细胞、B细胞、髓系细胞和胸腺细胞[11]。DC上的PD-L1与其受体结合后,可产生抑制信号,并诱导抗原特异性T细胞凋亡、无反应性和衰竭,对机体的免疫应答起负性调控作用[12]。基础研究表明,肿瘤微环境中存在的VEGF、IL-10、TGF-β等细胞因子可诱导树突状细胞PD-L1表达上调,使得肿瘤患者的DC成熟和功能障碍,激活T淋巴细胞能力降低,不能产生有效的抗肿瘤免疫反应,使肿瘤细胞发生免疫逃逸[13]。研究发现,PD-L1是参与肿瘤免疫逃逸过程的一个重要分子,因此封闭PD-L1/PD-1信号传导通路已成为肿瘤免疫治疗的一个重要策略。目的:本实验观察了应用shPD-1蛋白封闭PD-L1/PD-1信号传导通路,对肝癌患者DC刺激自体T淋巴细胞增殖、分泌细胞因子和刺激CTL杀伤能力的影响,进而探讨通过阻断负性调节信号PD-L1/PD-1来增强肝癌患者DC的免疫刺激能力,为DC瘤苗在临床中的应用提供新的思路。方法:以Ficoll密度梯度离心法从肿瘤患者外周血中分离出外周血单个核细胞( PBMC)后,再以粘附法获得单核细胞(Mo),应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子( rhGM-CSF)、白细胞介素-4( rhIL-4)、α-肿瘤坏死因子(rhTNF-α)体外诱导培养DCs;观察给予或不给予shPD-1蛋白对DC的影响。应用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测DC刺激自体T淋巴细胞的增殖能力, ELISA法测定上清液中IL -12p70的水平,MTT法检测效应淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性。结果:封闭DC表面PD-L1分子后,DC刺激T细胞增殖,分泌IL -12p70能力显著提高,促进CTL杀伤反应的能力显著增强(P<0.05)。结论:可溶性人PD-1蛋白(shPD-1)封闭DC表面PD-L1分子后能显著提高DC活化T细胞的能力,促进DC诱导的抗肿瘤免疫反应。

关键词：原发性肝癌树突状细胞 PD-L1 瘤苗肿瘤免疫

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中国创业板市场风险与防范问题研究

中国创业板市场风险与防范问题研究

作者：李江斌复旦大学

学位级别：硕士

十年磨一剑,随着深交所创业板开市铜锣的敲响,首批28家公司终于挂牌上市,开启在二级市场上的非凡之旅。创业板的推出无疑使得我国资本市场向多层次资本市场的发展方向迈出了一大步。由于创业板市场相对主板市场和中小板市场上市门槛更低... 详细信息

十年磨一剑,随着深交所创业板开市铜锣的敲响,首批28家公司终于挂牌上市,开启在二级市场上的非凡之旅。创业板的推出无疑使得我国资本市场向多层次资本市场的发展方向迈出了一大步。由于创业板市场相对主板市场和中小板市场上市门槛更低,为目前大量尚不符合主板和中小板上市条件的中小企业、新兴高科技行业尤其是那些具有自主创新的、颇具成长性的高科技企业开通了融资渠道,更为风险投资提供了一个较为方便而有效的退出渠道。但也正是由于创业板市场自身的这些特点,使它作为全新的投资品种和投资市场,在为投资者带来高额回报的同时也蕴藏着巨大的风险。本文在创业板推出之后,提出风险与防范的问题研究,目的是让研究分析不仅停留在理论假设的层面上,而是使创业板的研究更具有现实意义。我国的证券市场起步较晚,对于风险防范的制度建设丞待完善,本文通过对创业板市场的各方参与主体及相关中介结构进行分析,具体包括上市企业,投资者,证券公司以及监管机构等的研究,结合海外成功的纳斯达克市场,夭折的德国新市场和长期低迷的香港创业板的经验教训,探析各个环节可能存在的风险及防范措施,并同时跟踪创业板市场的实际运行情况,防患于未然,旨在最大限度的减小和化解市场风险,使创业板市场在监管层不断健全的相关监管制度的安排下平稳运行、健康发展。

关键词：创业板上市企业风险防范

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3-6岁幼儿发笑行为的研究

3-6岁幼儿发笑行为的研究

作者：李江斌南京师范大学

学位级别：硕士

本文是对发生在幼儿园场域当中的3-6岁幼儿发笑行为的研究。研究采用质的研究方法,通过现场观察进行数据资料的收集,主要从发笑客体(即笑料)、发笑情境,以及发笑主体(即发笑者)三个层面,对3-6岁幼儿的发笑机制进行了较为深入的分析。同... 详细信息

本文是对发生在幼儿园场域当中的3-6岁幼儿发笑行为的研究。研究采用质的研究方法,通过现场观察进行数据资料的收集,主要从发笑客体(即笑料)、发笑情境,以及发笑主体(即发笑者)三个层面,对3-6岁幼儿的发笑机制进行了较为深入的分析。同时对幼儿发笑行为的价值与意义,以及笑与幼儿教育的关系进行了一定的探讨。本研究主要分为七大部分：第一章是绪论部分,主要是关于研究的缘起、意义,以及国内外研究的梳理。第二章是关于本研究的研究设计和过程,主要对本研究的关键概念进行了界定,以及对研究的目的、问题、资料的收集,以及研究的分析思路进行了一定的说明。研究的结果分为四个部分,第三章是研究结果之一,是对笑的客体,即幼儿发笑的内容、对象进行的具体分析。第四章是研究结果之二,是对笑的情境,即幼儿发笑行为发生的场景(包括活动场景和场景中的人际环境)的具体分析。第五章是研究结果之三,是对笑的主体,即幼儿自身(包括年龄、性别、社会性经验和心理状态)的具体分析。第六章是讨论与分析,主要是关于幼儿发笑行为的价值与意义的探讨,并且对幼儿教育提出了一些建议。最后是本研究的结语部分,研究者对本研究的过程和结论进行了回顾和总结,并对本研究的不足和未来的研究空间进行了反思和探讨。通过本研究的分析和讨论,对于“幼儿为什么发笑”这个核心问题,本文得出了这样的结论：发笑行为的发生是一个主客体之间双向激活的过程,即刺激物(客体)要能具备激发接收者(主体)发笑的特征,而反过来接收者(主体)要有能理解、识别、欣赏事物可笑性的心理状态,并且这时候的情境条件是允许他们这么做的。只有这样,笑最终才可能产生。具体来说,笑的刺激物需要具有不协调性的特点;发笑者当时应该处于一种游戏、无害、安全、突然的情境当中;发笑者具备发笑的心理机能,亦即或感到认知上的失谐,或感到自身的优越,或感到一种内在能量的释放,或兼而有之。

关键词：幼儿发笑行为幽默培养快乐教育

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钢制实体保持架兜孔加工工艺改进

轴承 2017年第5期 12-14页

作者：李江斌刘兢洛阳轴研科技股份有限公司河南洛阳471039 河南省高性能轴承技术重点实验室河南洛阳471039 滚动轴承产业技术创新战略联盟河南洛阳471039

针对40CrNiMoA钢制实体保持架原兜孔加工中,由于保持架材料硬度高、黏性大,容易出现兜孔表面粗糙度大,甚至出现划伤的问题,改进原铣削加工为镗削通孔,采用硬质合金刀片,通过加工试验对比,验证了改进后工艺的有效性。

关键词：滚动轴承实体保持架 40Cr Ni Mo A 兜孔镗孔

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轴承卷边防尘盖压装质量改进

轴承 2018年第8期 12-15页

作者：马莹张军李江斌曾莉洛阳轴承研究所有限公司河南洛阳471039 河南省高性能轴承技术重点实验室河南洛阳471039 滚动轴承产业技术创新战略联盟河南洛阳471039

针对带卷边防尘盖密封轴承装配合格率低的现状,以62XX-2Z轴承防尘盖装配为调查对象,从人、机、料等方面分析影响一次压装合格率低的末端因素,最终确定模具结构、压装轴向力和模具锥面角为3个要因。通过改进压装模具结构,试验确定最佳压... 详细信息

针对带卷边防尘盖密封轴承装配合格率低的现状,以62XX-2Z轴承防尘盖装配为调查对象,从人、机、料等方面分析影响一次压装合格率低的末端因素,最终确定模具结构、压装轴向力和模具锥面角为3个要因。通过改进压装模具结构,试验确定最佳压装轴向力和模具锥面角,使得压装合格率大幅提高。

关键词：密封轴承卷边防尘盖模具压装轴向力模具锥面角

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基于PLC控制的刮板输送机监控系统设计

矿业装备 2022年第1期 8-9页

作者：李江斌晋能控股煤业集团赵庄煤业山西长治046000

文章针对当前煤矿综采工作面刮板输送机运行现状,以具体综采工作面为例,结合国产刮板输送机构成及性能特点,进行了基于PLC技术的刮板输送机监控系统设计探讨,并且通过搭建试验平台所获取的试验结果证明了所设计的基于PLC技术的刮板输送... 详细信息

文章针对当前煤矿综采工作面刮板输送机运行现状,以具体综采工作面为例,结合国产刮板输送机构成及性能特点,进行了基于PLC技术的刮板输送机监控系统设计探讨,并且通过搭建试验平台所获取的试验结果证明了所设计的基于PLC技术的刮板输送机监控系统的可行性与适用性。

关键词： PLC 刮板输送机监控系统设计

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采煤机截割滚筒自适应调高技术研究

机械管理开发 2022年第2期37卷 101-103,108页

作者：李江斌晋能控股煤业集团赵庄煤业山西长治046000

针对煤矿井下综采工作面采煤机截割滚筒控制存在的调高方案落后、自适应能力差的问题,研究基于采煤机工艺的自适应调高技术。在分析采煤机以及截割滚筒运动规律的基础上,以采煤机运行时间、截割滚筒运行时间之间的关系,分别讨论截割滚... 详细信息

针对煤矿井下综采工作面采煤机截割滚筒控制存在的调高方案落后、自适应能力差的问题,研究基于采煤机工艺的自适应调高技术。在分析采煤机以及截割滚筒运动规律的基础上,以采煤机运行时间、截割滚筒运行时间之间的关系,分别讨论截割滚筒调高控制策略。经试验验证表明,该截割滚筒自适应调高策略可减少采煤机在水平方向非必要运行时间12%~22%,非必要运行距离16%~28%,自适应能力较好,保证了采煤机工作效率。

关键词：运动规律自适应调高截割滚筒调高策略采煤机