绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的原核表达、生物信息学分析及鼠源多克隆抗体的制备

作     者：邓博文 刘晓艳 王永飞 靳玲 李江斌 哈尔勒哈·阿曼太 蔡江 李有文 

作者机构：塔里木大学动物科学与技术学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技兵团重点实验室 新疆生产建设兵团南疆动物疫病诊断与防控工程实验室 新疆生产建设兵团农一师畜牧兽医工作站 新疆焉耆回族自治县畜牧兽医局 

出 版 物：《黑龙江畜牧兽医》 (Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：新疆生产建设兵团区域创新基金项目(2021BB014) 塔里木大学校长基金项目(TDZKCX202305) 

主　　题：绵羊肺炎支原体 DnaJ 原核表达 生物信息学 多克隆抗体 

摘      要：为了解绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的免疫原性和生物学功能,并获得其鼠源多克隆抗体,试验先以绵羊肺炎支原体基因组DNA为模板,PCR扩增DnaJ基因,将该基因片段插入至原核表达载体pET-42b中构建重组质粒pET42bDnaJ,将重组质粒pET42b-DnaJ转化至BL21(DE3)感受态细胞中,获得重组菌pET42b-DnaJ/BL21(DE3);然后用IPTG对重组菌进行诱导表达,对表达的重组蛋白进行可溶性分析、鉴定和纯化;随后采用生物信息学软件对绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白进行生物信息学分析(亲水性、跨膜区域、B细胞抗原表位、磷酸化位点、二级结构、三级结构、亚细胞定位预测);最后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并分别通过间接ELISA方法和Western-blot方法检测绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白鼠源多克隆抗体的效价和及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组表达菌在41.5 ku处出现目的条带,与预期大小相符,重组蛋白主要以包涵体形式表达;可与鼠抗His标签抗体特异性结合,纯化后重组蛋白在正确位置出现单一的特异性条带,质量浓度为0.24 mg/m L。经生物信息学分析,绵羊支原体DnaJ蛋白亲水性区域分布在第1～10,12～18,20～30,32～57,61～91,108～129,141～182,190～198,204～228,230～239,247～262,264～281,291～308,311～318,321～337,347～358,361～376位氨基酸位点;为膜外蛋白,无跨膜区域;存在13个B细胞抗原表位,分别分布在5～24,26,28,30～90,111～128,137～209,211～221,246～254,267～273,302～314,323～333,246～256,360～372位氨基酸位点;共存在67个磷酸化位点,其中包含35个丝氨酸位点、18个苏氨酸位点和14个酪氨酸位点;二级结构主要为无规则卷曲和α-螺旋,然后依次为延伸链、β-转角,参与这4种二级结构构成的氨基酸分别占氨基酸总量的48.40%、25.40%、19.79%、6.42%;预测的三级结构与二级结构结果一致;亚细胞定位于细胞质中。制备的绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白鼠源多克隆抗体效价为1∶12 800,能与重组蛋白特异性结合。说明绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的免疫原性,由其制备的鼠源多克隆抗体效价较高、特异性较好。