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负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定

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负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定

作者：李丰耀暨南大学

学位级别：硕士

目的：构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体，在大肠杆菌中表达该融合蛋白，并进一步制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体。方法：以RT-PCR法... 详细信息

目的：构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体，在大肠杆菌中表达该融合蛋白，并进一步制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体。方法：以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA，以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。优化HLA-A*1101-BSP在大肠杆菌中的诱导表达的温度、时间和诱导剂IPTG浓度，并以抗HLA-A*0201抗血清进行免疫印迹鉴定HLA-A11-BSP的表达水平。将初步纯化的HLA-A*1101-BSP与β-微球蛋白(βm)和HCMV抗原肽pp65(GPISGHVLK，简称GPI)一起利用稀释法进行重折叠复性，获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体，经生物素化和纯化后，与Streptavidin-PE结合形成四聚体，以流式细胞仪分析四聚体的染色特性。结果：从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA，以此cDNA为模板，将编码HLA-A*1101重链胞外域1—276序列与编码BSP的序列融合，构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体，重组质粒经测序验证完全正确。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达，约占菌体总蛋白的20％;其相对分子质量约为35000，与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物存在于包涵体中，上清液中几乎无任何产物存在。重链分子在轻链βm和抗原肽GPI存在下进行体外复性，获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体，经生物素化并以阴离子交换柱层析分离，得到生物素化的纯化单体，后者与Streptavidin-PE按4：1比例混合后形成HLA-A*1101-GPI四聚体，多聚化程度达80％。流式细胞仪分析显示HLA-A*1101-GPI四聚体具有与特异性细胞毒T细胞(CTL)的结合活性。结论：成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体，该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达，并进一步获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体和四聚体，为研究HLA-A*1101限制性CTL的免疫应答打下基础。

关键词：人类白细胞抗原生物素化酶底物肽融合蛋白原核表达 HLA-A*1101 四聚体流式细胞术巨细胞病毒

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“中国第一所大学”的天大与北大之争

小康 2018年第11期 92-93页

作者：李丰耀不详

天大、北大对外正式的表述分别是"中国第一所现代犬学"和"中国第一所国立综合性大学",两校很少脱离上述限定语直接宣称"第一所大学",两校的定位都有其合理性。北京大学作为近代中国正式设立的第一所大学,家喻户晓,深入人心:而民津大学(... 详细信息

天大、北大对外正式的表述分别是"中国第一所现代犬学"和"中国第一所国立综合性大学",两校很少脱离上述限定语直接宣称"第一所大学",两校的定位都有其合理性。北京大学作为近代中国正式设立的第一所大学,家喻户晓,深入人心:而民津大学(前身为北洋犬学)也自称"中国第一所现代大学",这是为什么?看似风格迥异的两校有什么历史渊源?

关键词：综合性大学近代中国北大北京大学现代大学历史渊源定语

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兰州百合多倍体离体诱导及其分子细胞鉴定

草业学报 2024年第7期33卷 172-181页

作者：符勇耀蔡莉李丰耀杨文俊徐文姬姜思佳杨利平长江师范学院现代农业与生物工程学院重庆408100 黑龙江省森林植物园黑龙江哈尔滨150040

兰州百合是我国最重要的可食用甜百合。为培育优质的百合新种质,用不同浓度的秋水仙素离体诱变兰州百合小鳞茎,通过不定芽诱导获得变异幼苗。利用染色体倍性分析、幼苗早期形态观察及ISSR分子标记对其进行鉴定。结果表明,用0.15%秋水仙... 详细信息

兰州百合是我国最重要的可食用甜百合。为培育优质的百合新种质,用不同浓度的秋水仙素离体诱变兰州百合小鳞茎,通过不定芽诱导获得变异幼苗。利用染色体倍性分析、幼苗早期形态观察及ISSR分子标记对其进行鉴定。结果表明,用0.15%秋水仙素处理小鳞茎48 h诱导效果最好,变异率为58.06%。选择2个形态变异且生长较快的幼苗进行流式细胞仪分析和根尖压片计数,发现其中1个变异株系含36条染色体的细胞数比例达到了80%,接近纯合三倍体。形态学观察显示,2个变异幼苗的叶片、鳞茎及根系与对照相比存在显著差异,且气孔保卫细胞大于对照,气孔密度降低。ISSR标记检测表明,2个诱变株系与对照相比均发生遗传变异,变异率分别为19.64%和20.91%。研究结果可为获得兰州百合三倍体新种质及秋水仙素诱变育种提供重要参考依据。

关键词：兰州百合多倍体秋水仙素 ISSR标记

HLA-A^＊2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

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生物工程学报 2007年第2期23卷 284-291页

作者：贾仟涛徐丽慧李丰耀查庆兵何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心广州510632 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广州510632 暨南大学附属第一医院临床实验中心广州510632

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生... 详细信息

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(***)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在***中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24+供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8+T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。

关键词：四聚体 HLA-A^*2402 巨细胞病毒密码子优化原核表达包涵体

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青少年儿童家庭近视防控教育调查分析

玻璃搪瓷与眼镜 2022年第7期50卷 24-28页

作者：李丰耀周岚上海健康医学院上海201318

当前我国青少年儿童近视愈演愈烈,近视防控的主要战场已悄然走进家庭,家庭教育在预防近视上有不可替代的作用。采用网络问卷调查法,收集青少年儿童在家时用眼情况,以及家长对子女的近视防控教育程度,经分析发现家庭的近视防控教育意识... 详细信息

当前我国青少年儿童近视愈演愈烈,近视防控的主要战场已悄然走进家庭,家庭教育在预防近视上有不可替代的作用。采用网络问卷调查法,收集青少年儿童在家时用眼情况,以及家长对子女的近视防控教育程度,经分析发现家庭的近视防控教育意识正在逐步养成,部分家庭存在专业能力不足、工作繁忙,造成没有时间管理子女、轻视子女用眼教育等问题。建议我国应进一步重视近视防控的家庭教育,创新和改进防控方法。

关键词：近视防控青少年儿童家庭教育

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可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

生物工程学报 2007年第1期23卷 106-111页

作者：徐丽慧迟晓云李丰耀贾仟涛查庆兵何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-... 详细信息

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL^100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。

关键词： PD-L1 原核表达重折叠亲和层析抗体

HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第2期23卷 97-101页

作者：贾仟涛徐丽慧查庆兵李丰耀何贤辉曾耀英暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心广东广州510632 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广东广州510632

目的优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽(BSP)与HLA-A0203重链胞外域的融合蛋白(HLA-A0203-BSP),并制备负载HLA-A0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3596-604的四聚体(HLA-A0203/SVR)。方法以HLA-A0203-BSP原核表达载体转化***21(DE3)菌株,优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A0203/SVR单体,然后以BirA对其进行生物素化,并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A0203/SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体,通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果当IPTG的浓度为0.4mmol/L,于37℃诱导过夜后,融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量(Mr)为34000,与HLA-A0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分,约占菌体总蛋白的30%。负载抗原肽的可溶性HLA-A0203/SVR单体是在同时存在HLA-A0203-BSP、β2微球蛋白及HLA-A0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术(FCM)分析证实,该四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性。结论HLA-A0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A0203/SVR四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性,为研究HLA-A0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。

关键词： HLA—A*0203 EB病毒四聚体原核表达融合蛋白包涵体

探究如何提升企业管理者对员工的谈话掌控能力

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中国市场 2022年第16期 113-115页

作者：蔡蕊张邹妍蹇栗栗李丰耀张严西安石油大学经济管理学院陕西西安710399 上海健康医学院医疗器械学院上海201418 上海海事大学交通运输学院上海200120 西安石油大学机械工程学院上海健康医学院医学技术学院

企业管理者与员工的谈话是每个企业都会经历的事情,但是多数企业管理者缺乏一定的谈判技巧,常常会使结果与对话目标相去甚远,不利于企业的长远发展,提升每一次谈话的效率与质量,是小组每一位成员的最终目标。目前企业管理者与员工谈话... 详细信息

企业管理者与员工的谈话是每个企业都会经历的事情,但是多数企业管理者缺乏一定的谈判技巧,常常会使结果与对话目标相去甚远,不利于企业的长远发展,提升每一次谈话的效率与质量,是小组每一位成员的最终目标。目前企业管理者与员工谈话时存在的不足有:将员工视为理性的“经济人”;管理者无法控制自身情绪;在员工做出让步后依然期望员工做出更大的让步,通过归纳现有理论方法并基于实践不断革新,得出提升企业管理者对员工的谈话掌控能力的方法:重复员工所说的话;电台主持人般的嗓音;标注对方的情感;指控审查;校准问题。

关键词：企业管理者谈话掌控能力企业员工

健康青年人HCMV特异性CD8^+T细胞频率和表型分析

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免疫学杂志 2007年第3期23卷 260-264,269页

作者：查庆兵徐丽慧刘芳孙荭贾仟涛李丰耀何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心暨南大学生物工程研究所暨南大学附属第一医院临床实验中心广州510632

目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪... 详细信息

目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析。结果健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8+T细胞,占CD8+T细胞的百分率为0.14~6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P<0.001);CD57+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P<0.001)。同时,对三例健康青年人CD8+T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子。结论青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8+T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成。

关键词：四聚体技术人巨细胞病毒记忆型CD8^+T细胞流式细胞术