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肠聚集性大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及其在环境中的杀菌效果评估

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肠聚集性大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及其在环境中的杀菌效果评估

作者：李一昊南京农业大学

学位级别：硕士

肠聚集性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC）是一种可以在肠道上皮细胞表面形成“叠砖样”聚集的致病性大肠杆菌,是导致第三世界国家儿童腹泻的主要原因之一,也是旅行者腹泻第二大病原菌。EAEC主要通过粪口传播,2011... 详细信息

肠聚集性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC）是一种可以在肠道上皮细胞表面形成“叠砖样”聚集的致病性大肠杆菌,是导致第三世界国家儿童腹泻的主要原因之一,也是旅行者腹泻第二大病原菌。EAEC主要通过粪口传播,2011年在德国爆发的由产志贺毒素大肠杆菌（Shiga-Toxigenic Escherichia coli,STEC）引起的肠胃炎和溶血尿毒症综合征疫情造成了近四千人被感染,后查明是一株变异产生毒力基因stx2a的EAEC。治疗细菌疾病多采用抗生素疗法,然而越来越多的细菌不断产生对抗生素耐药性,如何有效杀灭此类致病菌成为医疗届的一个挑战。噬菌体是一种细菌病毒,可以针对某种类型的原核生物产生特异性的裂解作用。它广泛分布在自然界中,土壤和海洋内存在大量噬菌体,甚至在南极冰川中也有发现。噬菌体主要是由蛋白质外壳和内部的核酸组成,按照对宿主菌的裂解方式不同可以分为溶原性噬菌体和裂解性噬菌体,裂解性噬菌体又叫烈性噬菌体,它感染细菌的主要过程包括吸附、注入DNA、组装和释放,可以在短时间内裂解宿主菌并产生大量子代。研究证实噬菌体还可以对生物被膜态的细菌产生裂解作用。因其特异性较强和对人体动物体无毒副作用,在耐药菌频繁出现的今天,利用噬菌体来治疗细菌病或作为天然环境杀菌剂逐渐引起人们的重视。本试验旨在分离并筛选对EAEC具有较强裂解作用的噬菌体,测定其生物学特性,研究噬菌体及其混合制剂作为环境杀菌剂对宿主菌的杀灭效果。1噬菌体的分离、鉴定及生物学特性测定2018年自南京某鸡场、云南某猪场和学校动物房采集动物粪样共305份,选取实验室保存的EAEC菌株CVCC232做为宿主菌对粪样进行噬菌体的分离和纯化工作。共分离出噬菌体8株,对噬菌体进行体外裂解能力测定,选取裂解能力较强的两株噬菌体Φ11和Φ13作为下一步的研究对象。对两株噬菌体的宿主谱进行了测定,共随机选择了实验室167株不同动物源的大肠杆菌进行测定,结果显示Φ11可以裂解其中155株,Φ13可以裂解其中46株,表明其裂解谱较广。Φ11噬菌斑直径约为3 mm,有晕环;Φ13噬菌斑直径约为1mm,无晕环,两株噬菌体噬菌斑边缘均透亮、整齐。透射电镜观察噬菌体形态,确认两株噬菌体均为肌尾噬菌体。对噬菌体Φ11和Φ13的效价、最佳感染复数、一步生长曲线、对pH和温度的耐受性进行了测定,结果显示Φ11效价为5.4×109pfu/mL;最佳MOI=10;潜伏期为15 min,爆发期为65min,爆发量为52;在pH 3-11范围内均有活性;在70℃环境内可存活30min。Φ13效价为3.6×109pfu/mL;最佳MOI=10;潜伏期为15 min,爆发期为35 min,爆发量为21;在pH 3-11范围内均有活性;在60℃环境可存活1h,70℃处理30min即失活。2噬菌体作为环境杀菌剂对宿主菌的杀灭效果评估试验用密闭的塑料盒模拟了两个密闭的空间,比较了喷雾和雾化两种方式对环境中宿主菌的杀灭效果,结果表明不论是喷雾形式还是雾化形式的噬菌体制剂均可以杀灭空气中99%的宿主菌,且噬菌体在30 min内即可达到最高的杀菌效率。为研究噬菌体在养殖环境中的杀菌效率,进一步将噬菌体喷洒于地面和粪便,测定其对宿主菌的杀灭效果,结果显示Φ11在地面上对宿主菌杀灭效果明显优于Φ13,分别可杀灭99.3%和91.2%的宿主菌,但两者对粪便中宿主菌的杀灭效率相差无几,均可以杀灭粪便中99%以上的宿主菌,且混合使用对粪便中宿主菌的杀灭效率更高。试验还检测了两株噬菌体对生物被膜态的宿主菌的杀灭作用,首先将宿主菌在96孔板内经36 h培养形成生物被膜,随后加入噬菌体继续培养。结果表明Φ11对生物被膜态宿主菌杀灭效率达到73%,而Φ13的杀灭效率只有30%,混合制剂对被膜态宿主菌杀灭效率最高,达到了 83%。另对宿主菌接触噬菌体之后产生抗性菌株的概率进行了测定,将噬菌体和宿主菌共培养5h后,产生抗噬菌体菌株的概率大概为10-3。试验还测定了噬菌体在模拟养殖环境的温度（26℃和37℃）、粪便pH（6.0和8.5）条件下处理七天和阳光直射6小时下的活性变化,结果显示Φ11在37℃和pH 8.5处理七天后效价分别从 1.6×109pfu/mL 降至 2.4×1 08 pfu/mL、4.5×109pfu/mL降至 1.5×109pfu/mL,阳光直射 6 h 后效价从 1.6×109pfu/mL降至 2.8×108 pfu/mL;Φ13 在 37℃和pH 6.0 处理七天后,效价分别从 8.8×108pfu/mL 降至 1.7×107pfu/mL,1.1×109 pfu/mL 降至 2.9×108pfu/mL,阳光直射 6 h 后效价从 4.8×108pfu/mL 降至 4.5×

关键词：噬菌体肠聚集性大肠杆菌生物学特性环境杀菌剂

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略论太平天国和西方世界的关系

教育教学论坛 2016年第23期 200-202页

作者：李一昊曲阜师范大学文学院山东曲阜273165

19世纪中期的太平天国起义,由于发生在鸦片战争之后,中国逐步沦为半殖民地半封建社会的时代,所以遇到了如何同西方资本主义列强打交道的新课题,然而太平天国在处理这一问题上并不成功,他们缺少对国际社会的认知,外交策略混乱又矛盾,他... 详细信息

19世纪中期的太平天国起义,由于发生在鸦片战争之后,中国逐步沦为半殖民地半封建社会的时代,所以遇到了如何同西方资本主义列强打交道的新课题,然而太平天国在处理这一问题上并不成功,他们缺少对国际社会的认知,外交策略混乱又矛盾,他们虽有反侵略捍卫国家主权的意识,但有时又会把西方人幻想成洋兄弟,同时又有天朝上国唯我独尊的思想。这三种矛盾的心态导致了太平天国在外交上的失败和其在国际干涉下的覆灭。

关键词：太平天国西方世界国际形势覆灭

毒性病理学及人工智能数字组织图像分析质量控制概述

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中国新药杂志 2024年第5期33卷 441-448页

作者：滕伊洋张亚群李一昊钱庄汪溪洁吕建军中国医药工业研究总院上海201203 上海益诺思生物技术股份有限公司上海200043 益诺思生物技术南通有限公司南通226133 湖北天勤鑫圣生物科技有限公司武汉430207

随着人工智能和机器学习的快速发展,人工智能对全切片图像的诊断几乎可以媲美病理学家,建立人工智能算法需要大量的数字组织图像训练集数据。数字组织图像分析是通过各种算法分析全切片图像,并从其中提取大量复杂的定量数据集。数字组... 详细信息

随着人工智能和机器学习的快速发展,人工智能对全切片图像的诊断几乎可以媲美病理学家,建立人工智能算法需要大量的数字组织图像训练集数据。数字组织图像分析是通过各种算法分析全切片图像,并从其中提取大量复杂的定量数据集。数字组织图像分析的质量控制不仅非常重要,而且是确保建立高质量数据集和AI算法的基础和前提。本文简要概述了全切片图像的质量控制策略、数字组织图像分析的影响因素和质量控制方法、数字组织图像分析结果的质量控制方法、毒性病理学家在数字组织图像分析中的作用、数据解释和报告以及数字组织图像用于毒性病理学诊断及AI的挑战,以期为我国药物非临床安全性评价毒性试验中使用全切片图像进行毒性病理学诊断及建立AI各种算法提供一定参考。

关键词：毒性病理学人工智能数字组织图像分析质量控制全切片图像

临床前生物技术药物诱导免疫复合物的形成机制及检测方法研究进展

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药物评价研究 2022年第4期45卷 788-795页

作者：郑少秋李一昊王娅张亚群刘军吕建军汪溪洁江西中医药大学江西南昌330103 长三角药物高等研究院长三角药物高等工程学院江苏南通226133 益诺思生物技术南通有限公司江苏南通226133 上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203

生物技术药物的免疫原性在临床前药物安全性评价中表现为实验动物的超敏反应以及肾损伤,但其诱导免疫复合物形成的机制尚未完全明确。目前国内外主要通过检测动物体内循环态和沉积态的免疫复合物,来综合判断生物技术药物是否对动物造成... 详细信息

生物技术药物的免疫原性在临床前药物安全性评价中表现为实验动物的超敏反应以及肾损伤,但其诱导免疫复合物形成的机制尚未完全明确。目前国内外主要通过检测动物体内循环态和沉积态的免疫复合物,来综合判断生物技术药物是否对动物造成免疫复合物性肾损伤。简述了临床前生物技术药物诱导免疫复合物的形成、清除、沉积、毒性反应以及检测方法的研究进展,以期为建立早期、简便、灵敏的生物技术药物免疫复合物性肾损伤的检测技术提供一定参考。

关键词：生物技术药物免疫原性免疫复合物肾损伤超敏反应检测方法

特异性识别K1荚膜大肠杆菌的噬菌体PNJ1809-36生物学特性及全基因组分析

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畜牧兽医学报 2021年第6期52卷 1677-1688页

作者：巩倩雯李一昊曾颃于沛欣钱新杰王瑜欣戴建君汤芳南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际联合实验室农业农村部细菌学重点实验室南京210095

本研究以K1荚膜大肠杆菌DE058(avian pathogenic Escherichia coli )为宿主菌,从鸡粪中分离烈性噬菌体PNJ1809-36并对其进行生物学特性的研究和基因组测序及分析。将噬菌体PNJ1809-36进行分离纯化,通过形态学观察、最佳MOI测定、一步生... 详细信息

本研究以K1荚膜大肠杆菌DE058(avian pathogenic Escherichia coli )为宿主菌,从鸡粪中分离烈性噬菌体PNJ1809-36并对其进行生物学特性的研究和基因组测序及分析。将噬菌体PNJ1809-36进行分离纯化,通过形态学观察、最佳MOI测定、一步生长曲线测定、温度和酸碱耐受性测定、体外裂解能力测定以及全基因组测序及分析来研究该噬菌体的生物学特性和基因组特征。结果显示:噬菌体PNJ1809-36能够形成清晰透明的噬菌斑,其电镜照片显示为具有收缩尾部的肌尾科噬菌体;宿主谱分析结果显示,该噬菌体能够特异性裂解具有K1荚膜的大肠杆菌;最佳MOI为0.01;一步生长曲线结果显示,其潜伏期为10 min,爆发期为40 min;噬菌体PNJ1809-36在40和50 ℃下存活良好,60 ℃ 30 min可使噬菌体完全失活;噬菌体在pH3~11之间均可存活,最适pH为6;体外裂解试验表明,该噬菌体可在6 h内完全抑制宿主菌的生长。经基因组测序与分析,噬菌体PNJ1809-36基因组全长为152 343 bp,GC含量为39.11%,含有277个开放阅读框(ORF),11个tRNA基因。同源性分析显示其与早期发现的K1特异性的短尾噬菌体(如K1F、K1E)的同源性较低,而与噬菌体nepoznato、PVP-SE 1和phAPEC8等K1特异性噬菌体同源性较高,基因序列相似性达90%。噬菌体PNJ1809-36是一株特异性识别K1荚膜大肠杆菌的烈性噬菌体,属于肌尾科噬菌体新的系统发育分支。其针对K1荚膜的特性,提示该噬菌体在鉴定K1型大肠杆菌和治疗K1型大肠杆菌引起的疾病方面存在潜力。

关键词：噬菌体 K1荚膜大肠杆菌生物学特性全基因组分析

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药物发现过程中人工智能的应用研究进展

药物评价研究 2023年第9期46卷 2030-2036页

作者：李双星李一昊林志张頔杨艳伟屈哲李言川霍桂桃吕建军中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心北京市重点实验室北京100176 湖北天勤鑫圣生物科技有限公司湖北武汉430207

人工智能(AI)和机器学习不仅使药物发现和开发实现了质的飞跃,而且帮助药物开发进程进入现代化。机器学习和深度学习算法已应用于药物发现各个阶段,如先导化合物的筛选、多肽合成及小分子药物的发现、最佳给药剂量的确定、类药化合物的... 详细信息

人工智能(AI)和机器学习不仅使药物发现和开发实现了质的飞跃,而且帮助药物开发进程进入现代化。机器学习和深度学习算法已应用于药物发现各个阶段,如先导化合物的筛选、多肽合成及小分子药物的发现、最佳给药剂量的确定、类药化合物的设计和药物不良反应的预测、蛋白质间相互作用的预测、虚拟筛选效率的提高、定量构效关系(QSAR)建模和药物重新定位、理化性质和药物靶标亲和力的预测、化合物的结合预测和体内安全性分析、多靶点配体药物分子的设计以及临床试验的设计。简要综述了AI算法和传统化学相结合以提高药物发现的效率以及AI在药物发现过程中的应用研究进展,以期为AI应用于药物发现提供一定参考。

关键词：人工智能药物发现药物开发机器学习定量构效关系药物靶标

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细胞治疗产品的生物分布研究进展

中国新药杂志 2022年第19期31卷 1888-1894页

作者：钟小群张亚群闫振龙钱庄胡文元胡静陈晓俊李一昊吕建军李华益诺思生物技术南通有限公司南通226133

细胞治疗产品(cell therapy products,CTPs)的生物分布信息对于预测和评估其在非临床和临床研究中的药效和毒性作用特征至关重要。要进行细胞治疗产品的生物分布研究,必须了解其监管要求、实施状况和主要分析方法。本文简要介绍了国内... 详细信息

细胞治疗产品(cell therapy products,CTPs)的生物分布信息对于预测和评估其在非临床和临床研究中的药效和毒性作用特征至关重要。要进行细胞治疗产品的生物分布研究,必须了解其监管要求、实施状况和主要分析方法。本文简要介绍了国内外细胞治疗产品的生物分布研究相关监管指南或指导原则中关于生物分布研究的目的、时间安排和推荐方法,如定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和基于成像技术方法,包括正电子发射断层成像(positron emission tomography,PET)、单光子发射计算机断层成像(single photon emission computed tomography,SPECT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),以及生物发光成像(bioluminescence imaging,BLI)等方面的研究进展,旨在为我国细胞治疗产品的生物分布研究提供一定的参考。

关键词：细胞治疗产品生物分布监管指南定量聚合酶链反应基于成像技术方法

安徽部分地区猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

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畜牧与兽医 2020年第5期52卷 87-91页

作者：任建鸾张鹏殷晗杰黄豪胜杨德鸿曾颃李一昊南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室/南京农业大学动物医学院江苏南京210095

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是猪场仔猪黄白痢的重要病原之一。为调查安徽省猪场中ETEC的感染情况,在2018年对该省6个地区的17个规模化猪场的仔猪黄白痢样品进行了ETEC的分离鉴定。结果:经PCR鉴定,在479... 详细信息

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是猪场仔猪黄白痢的重要病原之一。为调查安徽省猪场中ETEC的感染情况,在2018年对该省6个地区的17个规模化猪场的仔猪黄白痢样品进行了ETEC的分离鉴定。结果:经PCR鉴定,在479份病料中分离出110株ETEC菌株。对这些菌株进行血清型、耐药性和致病力分析表明,该110株ETEC菌株共鉴定出13种血清型,以O8、O20、O128为优势血清型。110株ETEC菌株表现出高耐药性,对强力霉素的耐药率高达100%(110/110);对新霉素、红霉素、庆大霉素、阿莫西林、四环素等抗生素的耐药率均高达70%以上,且多数菌株表现出多重耐药,其中9、10重耐药菌株数最多。分别将优势血清型O8、O20、O128菌株对小鼠进行攻毒,结果同一血清型中强毒株数量分别占该血清型菌株总数的50%(55/110)、72.7%(8/11)和66.7%(4/6),表明这些优势血清型菌株的毒力普遍较高。本研究为猪场ETEC引起的仔猪黄白痢的流行病学研究及防控提供一定的参考。

关键词：产肠毒素大肠杆菌血清型耐药性毒力

EAEC噬菌体PNJ1809-11和PNJ1809-13作为环境消毒剂的杀菌效果评估

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微生物学报 2021年第7期61卷 2018-2030页

作者：钱新杰李一昊曾颃殷晗杰王瑜欣黄豪圣巩倩雯李德志薛峰汤芳戴建君南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

【目的】分析2株肠聚集性大肠杆菌(EAEC)CVCC232噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13的生物学特性,并对其作为环境消毒剂的杀菌效果进行评估。【方法】透射电镜下观察PNJ1809-11、PNJ1809-13的形态;通过宿主谱、最佳感染复数(MOI)、一步生长... 详细信息

【目的】分析2株肠聚集性大肠杆菌(EAEC)CVCC232噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13的生物学特性,并对其作为环境消毒剂的杀菌效果进行评估。【方法】透射电镜下观察PNJ1809-11、PNJ1809-13的形态;通过宿主谱、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、对pH和温度耐受性的测定分析PNJ1809-11、PNJ1809-13的生物学特性;比较2株噬菌体的体外杀菌效果和喷雾、雾化处理后的杀菌效果;检测噬菌体在模拟养殖环境下的耐受性,及喷雾处理的噬菌体制剂在模拟养殖环境下的杀菌效果和对宿主菌生物被膜的清除效果;分析宿主菌的抗性突变率。【结果】电镜下观察PNJ1809-11、PNJ1809-13均为肌尾病毒科噬菌体;PNJ1809-11可裂解155株大肠杆菌,PNJ1809-13可裂解46株大肠杆菌;噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13的最佳感染复数(MOI)均为10,最适pH均为7;与PNJ1809-13相比,PNJ1809-11具有较好的热稳定性;在模拟的封闭装置中,将两株噬菌体分别经喷雾、雾化处理后,二者对宿主菌的杀灭效果均可达99%以上;对人工污染的粪便表面细菌的杀灭效果均达到99%以上。噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13及两者的混合制剂(噬菌体鸡尾酒)对宿主菌CVCC232形成的生物被膜的裂解效率分别为78%、30%和83%。噬菌体PNJ1809-11在养殖温度、粪便pH以及阳光照射下,其耐受性均强于PNJ1809-13。宿主菌对PNJ1809-11、PNJ1809-13的抗性突变率分别为2.5×10^(-3)和1.0×10^(-3)。【结论】综上,噬菌体PNJ1809-11的环境耐受力更强,噬菌体鸡尾酒对生物被膜的裂解效果更好,提示噬菌体PNJ1809-13或噬菌体鸡尾酒经喷雾处理后具有作为环境杀菌剂的潜力。

关键词：噬菌体噬菌体鸡尾酒消毒剂耐受性生物被膜