肠聚集性大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及其在环境中的杀菌效果评估

作     者：李一昊 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：祝昊丹;汤芳

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：噬菌体 肠聚集性大肠杆菌 生物学特性 环境杀菌剂 

摘      要：肠聚集性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC）是一种可以在肠道上皮细胞表面形成“叠砖样聚集的致病性大肠杆菌,是导致第三世界国家儿童腹泻的主要原因之一,也是旅行者腹泻第二大病原菌。EAEC主要通过粪口传播,2011年在德国爆发的由产志贺毒素大肠杆菌（Shiga-Toxigenic Escherichia coli,STEC）引起的肠胃炎和溶血尿毒症综合征疫情造成了近四千人被感染,后查明是一株变异产生毒力基因stx2a的EAEC。治疗细菌疾病多采用抗生素疗法,然而越来越多的细菌不断产生对抗生素耐药性,如何有效杀灭此类致病菌成为医疗届的一个挑战。噬菌体是一种细菌病毒,可以针对某种类型的原核生物产生特异性的裂解作用。它广泛分布在自然界中,土壤和海洋内存在大量噬菌体,甚至在南极冰川中也有发现。噬菌体主要是由蛋白质外壳和内部的核酸组成,按照对宿主菌的裂解方式不同可以分为溶原性噬菌体和裂解性噬菌体,裂解性噬菌体又叫烈性噬菌体,它感染细菌的主要过程包括吸附、注入DNA、组装和释放,可以在短时间内裂解宿主菌并产生大量子代。研究证实噬菌体还可以对生物被膜态的细菌产生裂解作用。因其特异性较强和对人体动物体无毒副作用,在耐药菌频繁出现的今天,利用噬菌体来治疗细菌病或作为天然环境杀菌剂逐渐引起人们的重视。本试验旨在分离并筛选对EAEC具有较强裂解作用的噬菌体,测定其生物学特性,研究噬菌体及其混合制剂作为环境杀菌剂对宿主菌的杀灭效果。1噬菌体的分离、鉴定及生物学特性测定2018年自南京某鸡场、云南某猪场和学校动物房采集动物粪样共305份,选取实验室保存的EAEC菌株CVCC232做为宿主菌对粪样进行噬菌体的分离和纯化工作。共分离出噬菌体8株,对噬菌体进行体外裂解能力测定,选取裂解能力较强的两株噬菌体Φ11和Φ13作为下一步的研究对象。对两株噬菌体的宿主谱进行了测定,共随机选择了实验室167株不同动物源的大肠杆菌进行测定,结果显示Φ11可以裂解其中155株,Φ13可以裂解其中46株,表明其裂解谱较广。Φ11噬菌斑直径约为3 mm,有晕环;Φ13噬菌斑直径约为1mm,无晕环,两株噬菌体噬菌斑边缘均透亮、整齐。透射电镜观察噬菌体形态,确认两株噬菌体均为肌尾噬菌体。对噬菌体Φ11和Φ13的效价、最佳感染复数、一步生长曲线、对pH和温度的耐受性进行了测定,结果显示Φ11效价为5.4×109pfu/mL;最佳MOI=10;潜伏期为15 min,爆发期为65min,爆发量为52;在pH 3-11范围内均有活性;在70℃环境内可存活30min。Φ13效价为3.6×109pfu/mL;最佳MOI=10;潜伏期为15 min,爆发期为35 min,爆发量为21;在pH 3-11范围内均有活性;在60℃环境可存活1h,70℃处理30min即失活。2噬菌体作为环境杀菌剂对宿主菌的杀灭效果评估试验用密闭的塑料盒模拟了两个密闭的空间,比较了喷雾和雾化两种方式对环境中宿主菌的杀灭效果,结果表明不论是喷雾形式还是雾化形式的噬菌体制剂均可以杀灭空气中99%的宿主菌,且噬菌体在30 min内即可达到最高的杀菌效率。为研究噬菌体在养殖环境中的杀菌效率,进一步将噬菌体喷洒于地面和粪便,测定其对宿主菌的杀灭效果,结果显示Φ11在地面上对宿主菌杀灭效果明显优于Φ13,分别可杀灭99.3%和91.2%的宿主菌,但两者对粪便中宿主菌的杀灭效率相差无几,均可以杀灭粪便中99%以上的宿主菌,且混合使用对粪便中宿主菌的杀灭效率更高。试验还检测了两株噬菌体对生物被膜态的宿主菌的杀灭作用,首先将宿主菌在96孔板内经36 h培养形成生物被膜,随后加入噬菌体继续培养。结果表明Φ11对生物被膜态宿主菌杀灭效率达到73%,而Φ13的杀灭效率只有30%,混合制剂对被膜态宿主菌杀灭效率最高,达到了 83%。另对宿主菌接触噬菌体之后产生抗性菌株的概率进行了测定,将噬菌体和宿主菌共培养5h后,产生抗噬菌体菌株的概率大概为10-3。试验还测定了噬菌体在模拟养殖环境的温度（26℃和37℃）、粪便pH（6.0和8.5）条件下处理七天和阳光直射6小时下的活性变化,结果显示Φ11在37℃和pH 8.5处理七天后效价分别从 1.6×109pfu/mL 降至 2.4×1 08 pfu/mL、4.5×109pfu/mL降至 1.5×109pfu/mL,阳光直射 6 h 后效价从 1.6×109pfu/mL降至 2.8×108 pfu/mL;Φ13 在 37℃和pH 6.0 处理七天后,效价分别从 8.8×108pfu/mL 降至 1.7×107pfu/mL,1.1×109 pfu/mL 降至 2.9×108pfu/mL,阳光直射 6 h 后效价从 4.8×108pfu/mL 降至 4.5×