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作者：方相春第四军医大学

学位级别：硕士

疼痛是人们在不同的病理状态下由大脑所产生的一种不愉悦的感觉，而长期的慢性痛则在全世界的范围内成为严重影响患者生命质量的重要疾病。因此，阐明疼痛发生和传递的机制，开发更有效的镇痛新药以及临床上对于疼痛的靶向治疗，已经成... 详细信息

疼痛是人们在不同的病理状态下由大脑所产生的一种不愉悦的感觉，而长期的慢性痛则在全世界的范围内成为严重影响患者生命质量的重要疾病。因此，阐明疼痛发生和传递的机制，开发更有效的镇痛新药以及临床上对于疼痛的靶向治疗，已经成为当今生命科学研究领域的热点问题[1]。背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）和脊髓背角是躯体感觉信息（包括痛觉信息）传递和调控的初级门户，位于其内的谷氨酸在外周痛觉信息的传递中具有重要作用。已有的研究证实，在对痛觉信息的传递和调控过程中，谷氨酸是其中最主要的神经递质之一，谷氨酸在神经元的胞体合成后须由突触囊泡进行转运并胞吐释放才能发挥其兴奋性递质的作用，这种转运方式又必须借助特定的囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters, VGLUTs)来完成。近10年，研究人员利用快速发展的分子生物学技术成功地分离并克隆出了不同亚型的囊泡膜谷氨酸转运体，并将之命名VGLUT1、VGLUT2、 VGLUT3[2,3]。由于VGLUT1和VGLUT2广泛分布于谷氨酸能轴突终末内，故目前在国际上人们已经将VGLUT1和VGLUT2作为中枢神经系统内谷氨酸能终末的特异性标记物[4]。谷氨酸参与感觉信息的传递和调控的结构基础在于它不仅分布在投射神经元内，在中间神经元内也有广泛的分布，而新近研究也发现在长传导通路的各级核团和中间神经元内均有VGLUT2的分布;进一步的研究也证实DRG和脊髓背角内有大量的VGLUT2表达神经元和轴突终末[5]。目前在国内外由于缺乏针对VGLUT2特异性的激动剂和拮抗剂，导致对VGLUT2所参与外周痛觉信息传递和调控机制的研究十分困难[6,7]。随着分子生物学技术的迅速发展，基因敲除技术很好的解决了这一难题。然而，基因敲除技术对于针对VGLUT2为疼痛的靶点，作为临床上开发有效的镇痛药而言显然是不现实的。随着基因阻断技术的发展，RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）为特定基因功能研究和相关疾病的治疗提供了一种全新的思路。脊髓背角的中间神经元（同样作为躯体感觉信息传递和调控的关键部位），其内的VGLUT2与外周疼痛信息的传递和调控的关系如何，到目前为止尚不十分清楚。另外，脊髓内VGLUT2样阳性终末由于既来源于初级传入神经元（DRG），也来自于脊髓中间神经元本身，因此在慢性痛状态下，这两部分来源的VGLUT2究竟是怎样参与痛觉信息的传递和调控的，目前也无文献报道。针对这两个问题，我们拟综合采用RNA干扰技术结合顺行束路追踪、免疫荧光组织化学、细胞培养和电生理学技术从以下几个方面进行了研究。第一部分：将携带有两种不同VGLUT2shRNA序列的慢病毒载体，感染在体外原代培养的脊髓神经元，进一步验证并筛选能够最有效下调脊髓神经元内VGLUT2表达的慢病毒载体。目的：验证已经在体外培养的皮层神经元上筛选得到的可以特异性干扰VGLUT2表达的两种慢病毒是否能够有效地感染原代培养的大鼠脊髓神经元，筛选出能够最高效干扰培养脊髓神经元内的VGLUT2基因表达的慢病毒。方法：首先将这两种重组慢病毒直接感染体外培养的胚胎大鼠脊髓神经元，实验分为正常组、阴性对照组（空病毒载体组）、VGLUT2-shRNA-1组以及VGLUT2-shRNA-2组，分别观察各组大鼠脊髓神经元内绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达情况;同时运用免疫蛋白质印迹（Western Blot）技术检测VGLUT2蛋白的表达水平。结果：免疫荧光组织化学染色结果显示：阴性对照组、两组VGLUT2-shRNA慢病毒组脊髓神经元内均可以观察到GFP的荧光，提示这些神经元已经被慢病毒载体高效地感染;但两组VGLUT2-shRNA慢病毒组神经元内的VGLUT2的表达量要明显比正常组和阴性对照组低。Western Blot结果显示：两组VGLUT2-shRNA慢病毒组脊髓神经元内VGLUT2蛋白的表达量明显低于其他两组的表达量(P0.05);阴性对照组和正常组之间相比也无明显差异(P>0.05)。结论：两组VGLUT2-shRNA重组慢病毒均能高效地感染原代培养脊髓神经元，并且能够下调脊髓神经元内VGLUT2的表达。第二部分：将在体外有效降低VGLUT2的两种shRNA重组的慢病毒，通过定位注射方式注入大鼠脊髓背角，进而感染脊髓背角神经元，观察下调其内VGLUT2的表达对

关键词：谷氨酸 VGLUT2 神经病理性痛 DRG shRNA 慢病毒脊髓大鼠

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大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体转染原代培养脊髓神经元对VGLUT2表达的影响

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神经解剖学杂志 2012年第6期28卷 537-543页

作者：方相春张春奎唐君李志红张婷李金莲第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心西安710032

目的:探讨新构建的可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒载体能否有效地感染大鼠脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基因的特异性... 详细信息

目的:探讨新构建的可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒载体能否有效地感染大鼠脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基因的特异性干扰效果,从而为进一步在整体动物脊髓水平研究VGLUT2的功能提供有力的工具。方法:首先分别将已筛选到的两对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列两个位点的特异性shRNA序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经Age I和EcoRI双酶切)载体内,经酶切、测序鉴定及转染293T细胞,包装得到病毒颗粒。然后将筛选出的慢病毒感染体外分离、培养的胚胎大鼠脊髓神经元,将培养的原代神经元分为正常组、阴性对照组、VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组,在荧光显微镜下分别观察GFP的表达情况;同时运用Westernt blot检测各组VGLUT2蛋白的表达水平。结果:免疫荧光检测显示,阴性对照组、VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组脊髓原代培养神经元均能观察到明显的GFP荧光,表明这些神经元已被慢病毒载体高效转染;但VGLUT2 shRNA-1组和VGLUT2 shRNA-2组神经元VGLUT2的表达量明显低于正常组和阴性对照组。Western blot结果显示,VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组的VGLUT2蛋白的表达量与正常组和阴性对照组相比明显有所下降,分别占正常组的62.42±1.12%和66.07±1.33%(P0.05);阴性对照组与正常组相比亦无明显差异(P>0.05)。结论:VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组重组慢病毒载体均能有效地感染原代培养脊髓神经元,并高效下调其神经元内目的基因VGLUT2的表达。

关键词： VGLUT2 RNA干扰慢病毒载体脊髓原代培养神经元大鼠

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JAK-STAT信号转导通路在神经系统疾病中作用的研究进展

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神经解剖学杂志 2014年第2期30卷 237-240页

作者：张克英唐君方相春张春奎史娟李金莲第四军医大学口腔医学系 2010级学员南京210018 第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心西安710032 第四军医大学南京军区南京总医院麻醉科南京210018

JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由多种细胞因子刺激的信号转导通路，广泛的存在于多种细胞中。例如，JAK3存在于骨髓和淋巴系统，JAK2、STAT3存在于神经胶质细胞，而STATS则存在于海马神经细胞等。***信号通路不仅参与细胞的增殖... 详细信息

JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由多种细胞因子刺激的信号转导通路，广泛的存在于多种细胞中。例如，JAK3存在于骨髓和淋巴系统，JAK2、STAT3存在于神经胶质细胞，而STATS则存在于海马神经细胞等。***信号通路不仅参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程，还在发育分化、增殖的调控和维持中发挥重要作用。随着研究的不断深入，目前认为该信号传导途径的传递过程不仅复杂，而且其调控机制也精细多样，

关键词： JAK STAT 疼痛神经退行性疾病神经系统再生

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脊髓刺激术对神经病理性痛模型大鼠脊髓背角内NR2B受体和星形胶质细胞激活的影响

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神经解剖学杂志 2013年第3期29卷 233-240页

作者：张春奎方相春李志红唐君董玉琳李金莲第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心西安710032

目的:探讨脊髓刺激术(spinal cord stimulation,SCS)对L5脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)诱导的神经病理性痛(neuropathic pain,NP)大鼠脊髓背角内NMDA受体亚单位NR2B的表达和星形胶质细胞激活的影响。方法:成年雄性SD大鼠48只,随机分为4组:正常组(不做任何处理);SCS组(植入SCS装置并给予SCS刺激);SNL+sham SCS组(给予SNL手术并植入SCS装置,但不进行刺激);SNL+SCS组(SNL手术并给予SCS刺激)。SCS刺激是在SNL术后第6～10 d进行(8 h/d),第10 d刺激结束后处死动物。运用行为学方法检测慢性痛状态下大鼠后肢对机械性刺激的反应阈值;采用免疫组织化学染色和Western blot方法分别检测脊髓背角内NR2B和星形胶质细胞的标志物GFAP的表达变化。结果:(1)SNL术后大鼠手术侧后足机械性痛敏显著增加,第6～10 d给予SCS刺激后,可观察到大鼠的痛行为学表现有明显缓解;(2)免疫组化结果显示:与SNL+sham SCS组相比,SNL+SCS组大鼠脊髓背角内NR2B和GFAP免疫阳性细胞的数量显著减少;(3)Western blot结果显示:给予SCS刺激后,SNL大鼠腰膨大段脊髓背角内NR2B的表达量显著下调,同时GFAP的表达量也明显有所降低。结论:给予SCS刺激可以有效地缓解SNL模型大鼠的神经病理性痛的行为学表现;该作用可能与SCS刺激抑制脊髓背角内NR2B的表达和星形胶质细胞的激活密切相关。

关键词：脊髓刺激术神经病理性痛 NR2B 星形胶质细胞大鼠

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脊髓刺激术对神经病理性痛模型大鼠痛行为和脊髓背角内小胶质细胞激活的影响

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神经解剖学杂志 2012年第3期28卷 230-236页

作者：张春奎李志红方相春唐君齐建国李金莲第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心西安710032 四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学教研室成都610041

目的:探讨脊髓刺激术(spinal cord stimulation,SCS)对神经病理性痛(neuropathic pain,NP)模型大鼠痛行为及脊髓背角内小胶质细胞激活的影响。方法:成年大鼠20只,随机分为4组:(1)正常对照组(control组);(2)SCS组:正常大鼠给予SCS刺激;(3... 详细信息

目的:探讨脊髓刺激术(spinal cord stimulation,SCS)对神经病理性痛(neuropathic pain,NP)模型大鼠痛行为及脊髓背角内小胶质细胞激活的影响。方法:成年大鼠20只,随机分为4组:(1)正常对照组(control组);(2)SCS组:正常大鼠给予SCS刺激;(3)脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)假刺激组(SNL+shamSCS组):SNL且植入SCS装置,但不刺激;(4)SNL+SCS组:SNL且给予SCS刺激。术前连续3 d、术后第5 d检测各组大鼠足底机械痛敏阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)。SCS组和SNL+SCS组术后第2-5 d给予SCS刺激,每d持续8 h;且在每次给予SCS 8 h刺激前进行90 min行为学测试,即SCS刺激30 min,以及刺激结束后的60 min内(共90 min),每15 min测量一次MWT。在第5 d给予SCS 8 h刺激结束后处死动物,利用免疫组织化学染色结合平均光密度(average optical density,AOD)分析的方法检测各组大鼠腰5节段脊髓背角内小胶质细胞特异性标志物OX-42的表达情况。结果:(1)行为学结果显示:术后第5 d,SNL+shamSCS组和SNL+SCS组大鼠手术侧后爪的MWT由术前26.00±0.0 g分别降至5.50±0.96 g和6.40±0.40 g(P<0.05);SNL+SCS组给予SCS刺激30 min后大鼠手术侧后爪的MWT明显有所提高,达16.20±2.60 g,与刺激前(6.40±0.40 g)相比有显著性差异(P<0.05);但停止SCS刺激60 min后,大鼠的MWT明显有所下降,与刺激前几乎没有明显差别。(2)免疫组化染色结果显示:术后第5 d,SNL+SCS组脊髓背角内OX-42的表达明显弱于SNL+shamSCS组,但二者都强于control组和SCS组;AOD结果也证实:SNL+SCS组大鼠脊髓背角内OX-42的AOD(1.29±0.28)明显低于SNL+shamSCS组(2.66±0.38),但仍高于control组(0.14±0.21)和SCS组(0.24±0.08)。结论:SCS对SNL模型大鼠的神经病理性痛有较好的镇痛效果;该作用可能与SCS刺激显著抑制脊髓背角内小胶质细胞的激活密切相关。

关键词：脊髓刺激术神经病理性痛小胶质细胞 OX-42 大鼠

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脊髓刺激术对神经病理性痛模型大鼠脊髓背角NR2B表达和星形胶质细胞激活的影响

脊髓刺激术对神经病理性痛模型大鼠脊髓背角NR2B表达和星形胶质细...

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中国解剖学会2013年年会

作者：张春奎方相春董玉琳李金莲第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心

＜正＞近年来大量研究报道神经元内NMDA受体亚单位NR2B的表达增加在神经病理性痛的发生发展、尤其是疼痛慢性化中具有重要作用,而NR2B的表达增加亦与脊髓背角内星形胶质细胞的激活密切相关。脊髓刺激术（SCS）是一种将刺激电极通过手术...

＜正＞近年来大量研究报道神经元内NMDA受体亚单位NR2B的表达增加在神经病理性痛的发生发展、尤其是疼痛慢性化中具有重要作用,而NR2B的表达增加亦与脊髓背角内星形胶质细胞的激活密切相关。脊髓刺激术（SCS）是一种将刺激电极通过手术的方式置于相应脊髓节段的硬膜外间隙,并给以适宜的电刺激,从而达到镇痛目的的临床治

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Ⅰ型和Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体在三叉-小脑投射和三叉-丘脑投射通路内的差异表达

Ⅰ型和Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体在三叉-小脑投射和三叉-丘脑投射通...

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中国解剖学会2012年年会

作者：李志红葛顺楠唐君方相春李金莲第四军医大学人体解剖学与组织学胚胎学教研室

＜正＞三叉神经感觉核簇（TSNC）作为接受口面部感觉信息传入的初级门户,其内含有丰富的Ⅰ型和Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体（VGLUT1和VGLUT2）mRNA阳性神经元。本研究综合运用免疫组织化学、原位分子杂交、束路追踪与免疫荧光组织化学相结合

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人参皂甙Rd通过调节SNI大鼠背根神经节钠、钾电流抑制痛敏

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现代生物医学进展 2014年第12期14卷 2214-2218页

作者：杨菲张统一白录军徐春华方相春第四军医大学唐都医院疼痛生物医学研究所陕西西安710038 兰州军区临潼疗养院第二疗养区陕西西安710600 第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心陕西西安710032

目的:观察人参皂甙Rd(ginsenoside Rd)对大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared sciatic nerve injury,SNI)引起的痛敏的影响及其作用机制。方法:坐骨神经分支选择性损伤术后7天,观察腹腔注射不同浓度人参皂甙Rd后大鼠后足的机械性缩足反... 详细信息

目的:观察人参皂甙Rd(ginsenoside Rd)对大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared sciatic nerve injury,SNI)引起的痛敏的影响及其作用机制。方法:坐骨神经分支选择性损伤术后7天,观察腹腔注射不同浓度人参皂甙Rd后大鼠后足的机械性缩足反应阈值(paw withdrawl mechanical threshold,PWMT)的变化;在术后7天,急性分离并取出大鼠腰4和腰5段背根节,对整节DRG上的中小型神经元运用全细胞膜片钳技术进行记录。结果:坐骨神经分支选择性损伤术后7天,大鼠出现明显的机械性痛敏,腹腔注射5 mg/ml和10 mg/ml的人参皂甙Rd能剂量依赖性的翻转大鼠机械性痛敏;坐骨神经分支选择性损伤能明显地增大SNI大鼠DRG中小型神经元上的钠电流以及减小电压依赖性钾电流,而100μM人参皂甙Rd能有效翻转该钠、钾电流的变化。结论:人参皂甙Rd能有效地改善坐骨神经分支选择性损伤引起的机械性痛敏,其机制可能与人参皂甙Rd明显地调节SNI大鼠DRG中小型神经元上的电压依赖性钠、钾电流有关。

关键词：人参皂甙Rd 机械性痛敏钠电流钾电流

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鞘内注射雷公藤内酯醇对神经病理性痛大鼠脊髓背角内胶质细胞活化的影响和镇痛效果

鞘内注射雷公藤内酯醇对神经病理性痛大鼠脊髓背角内胶质细胞活化...

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中国解剖学会2012年年会

作者：唐君方相春李志红汪伟梅晓鹏徐礼鲜李金莲第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室第四军医大学口腔医院麻醉科

＜正＞近来研究发现雷公藤内酯醇（T10）在治疗帕金森（PD）和老年性痴呆（AD）过程中,可以通过抑制胶质细胞的活性而发挥神经保护作用。然而T10是否能够通过调节神经病理性痛过程中胶质细胞的功能而发挥镇痛作用呢?到目前为止尚未见报...

＜正＞近来研究发现雷公藤内酯醇（T10）在治疗帕金森（PD）和老年性痴呆（AD）过程中,可以通过抑制胶质细胞的活性而发挥神经保护作用。然而T10是否能够通过调节神经病理性痛过程中胶质细胞的功能而发挥镇痛作用呢?到目前为止尚未见报道。本实验运用脊神经结扎大鼠模型（SNL）,综合利用行为药理学、分子生物学和免疫荧光组织化学等方法研究了鞘内注射T10后对SNL诱导的大鼠痛行为、胶质细胞活化及相关信号分子表达和炎

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大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建、鉴定及转染原代培养神经元对VGLUT2表达的影响

大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建、鉴定及转染原代培养神经...

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中国神经科学学会第十届全国学术会议

作者：方相春葛顺楠张春奎唐君李志红张婷李金莲第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心

目的构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2）shRNA的慢病毒载体,探讨新构建的慢病毒载体能否有效地感染大鼠皮层和脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基因的特异性干扰效果... 详细信息

目的构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2）shRNA的慢病毒载体,探讨新构建的慢病毒载体能否有效地感染大鼠皮层和脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基因的特异性干扰效果。方法（1）在体外合成四对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列四个位点的特异性短发卡RNA序列（VGL,UT2-shRNA-1,2,3,4）和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒载体内,经酶切及测序鉴定正确后,将其与辅助质粒共转染T293细胞,包装得到病毒颗粒。（2）将各组病毒载体分别转染原代培养的大鼠皮层和脊髓神经元,感染实验共分为以下6组:1-4组分别为pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1组、2组、3组、4组;pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-阴性对照组和空白对照组。运用免疫荧光和Western blot方法检测各组蛋白的表达水平,并筛选出下调效果最佳的病毒载体。结果（1）pGCSIL-GFP质粒克隆得到的VGLUT2 shRNA序列正确,包装得到的病毒可以有效地感染大鼠皮层和脊髓原代培养神经元;（2）免疫荧光检测结果显示:pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1、2、3、4组和阴性对照组共5组皮层和脊髓原代培养神经元均能观察到明显的GFP荧光,表明这些神经元已被慢病毒载体高效转染;其中第3组和第4组神经元VGLUT2的免疫荧光强度明显低于1、2组、正常组和阴性对照组,表明第3、4组能够更有效地降低原代培养神经元内VGLUT2的免疫荧光强度。（3）Western blot结果显示:pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1、2、3、4组的VGLUT2蛋白的表达量与正常组和阴性对照组相比明显有所下降,分别占正常组的63.9±5.82%,73.8±3.18%,39.1.8±1.99%和35.1.8±1.72%;且pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-3、4组的VGLUT2蛋白的表达量明显低于pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1、2组（P＜0 05）;但阴性对照组与正常组相比亦无明显差异（P＞0.05）。结论本研究成功构建出表达针对大鼠VGLUT2基因shRNA的慢病毒载体,并可有效下调VGLUT2的表达,为进一步在体研究VGLUT2的功能提供了有力的工具。

关键词： 2型囊泡膜谷氨酸转运体慢病毒载体原代培养神经元

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