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心肌组织工程支架材料研究进展

中国修复重建外科杂志 2011年第3期25卷 361-364页

作者：方易冰廖斌泸州医学院附属医院心胸外科四川泸州646000

目的对心肌组织工程支架材料的研究现状与存在问题进行综述,并展望其前景。方法广泛查阅近年来有关心肌组织工程支架材料的文献,并进行综述。结果作为组织工程中的三大要素之一,合适的支架材料对种子细胞的生长和分化具有重要意义;在心... 详细信息

目的对心肌组织工程支架材料的研究现状与存在问题进行综述,并展望其前景。方法广泛查阅近年来有关心肌组织工程支架材料的文献,并进行综述。结果作为组织工程中的三大要素之一,合适的支架材料对种子细胞的生长和分化具有重要意义;在心肌组织工程领域,生物支架材料和人工合成支架能够通过其内的活性成分仿生细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的结构和功能特点;随着去细胞技术的不断更新,自然源性的ECM已经表现出巨大优势。结论采用复合支架原理,利用计算机和纳米高分子技术等高科技,结合传统心肌组织工程支架生物材料,对生物材料进行表面修饰,有望为心肌组织工程提供较理想的支架材料。

关键词：心肌组织工程生物支架材料人工合成支架复合支架

慢病毒介导HCN2基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

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慢病毒介导HCN2基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

作者：方易冰泸州医学院

学位级别：硕士

目的：探讨通过超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道2 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN2)基因稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的可行性。探求HCN2转染的最佳感染复数(multiplication of infection, MOI),为进一步研究起搏电流的电生理学特性提供前期实验基础。方法：1.骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定：采用改良全骨髓贴壁培养的方法分离纯化BMSCs,培养于含20%FBS的DMEM培养基,并传代培养;观察培养细胞的生长状态;通过CD34、CD4、CD45、CD90免疫组织化学和流式细胞技术进行细胞鉴定。应用体外成骨诱导,观察BMSCs向成骨细胞分化的功能特性。2.对购得的HCN2质粒进行扩增和纯化,对纯化质粒行蛋白电泳和基因测序,鉴定HCN2基因。3.重组慢病毒(Feline immunodeficiency virus,FIV)载体HCN2的构建及其鉴定：将鉴定正确的重组慢病毒进行扩增、纯化和滴度测定。以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因为信号基因,确定最佳感染复数;观察FIV-EGFP转染BMSCs表达强度随时间的变化情况;流式细胞检测FIV-HCN2转染BMSCs的细胞活力的变化。结果：1.改良全骨髓贴壁分离法法获得了高纯度(>90%)和高活力(>90%)的BMSCs,经形态学观察和免疫组织化学检测,显示所培养细胞呈梭形、纺锤形和多角形,免疫化学染色CD44、CD90阳性,CD34阴性,符合BMSCs的形态和表面标记;流式细胞仪分析,CD44、CD90阳性细胞分别占99.5%、90.9%。体外成骨诱导BMSCs,茜红素染色可见大量钙结节后,说明BMSCs具有向成骨细胞分化能力。2. HCN2的质粒扩增方法可靠,扩增的质粒经双酶切证实基因片段大小正常,目的基因测序结果证实与GeneBank上基本一致。3.重组慢病毒HCN2的构建。使用包装病毒上清液做慢病毒滴度检测未见荧光;用上清液感染BMSCs,24h、48h、72h也未检测出有意义的绿色荧光。结论：1.采用改良全骨髓贴壁法,可分离获得较高纯度、高活力的BMSCs。BMSCs体外增殖速度快,可短期内达到实验所需要细胞数量。2.含有HCN2的质粒扩增方法可靠,扩增的质粒经双酶切证实基因片段大小正常,目的基因测序结果证实与GeneBank上基本一致。3.重组慢病毒HCN2转染干细胞有待进一步研究。

关键词： HCN2 骨髓间充质干细胞慢病毒大鼠转染

重组慢病毒介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4基因转染BMSCs的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2013年第12期27卷 1512-1516页

作者：于风旭方易冰刘炫赖前成贾建博廖斌泸州医学院附属医院心胸外科四川泸州646000

目的探讨重组慢病毒（1entivirus，LVs）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpo。***4，HCN4）基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性。方法选取3～5周龄SD大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。以LVs作为转... 详细信息

目的探讨重组慢病毒（1entivirus，LVs）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpo。***4，HCN4）基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性。方法选取3～5周龄SD大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。以LVs作为转染载体，增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）为标记，构建***病毒液。取第3代BMSCs分别转染LVs—***病毒液（实验组）和***空白病毒液（对照组），荧光显微镜观察转染24、48、72h后两组绿色荧光表达情况，72h时Westernblot检测HCN4蛋白表达；电生理检测实验组转染72h后BMSCs的起搏电流。结果实验组BMSCs形态正常、生长良好；48h后荧光显微镜下可见散在的绿色荧光，转染效率约10％；72h荧光表达稍增多，转染效率为20％～25％。对照组未见绿色荧光表达。Westernblot检测示转染72h后，实验组可见与HCN4蛋白相对分子质量相同的条带表达，而对照组仅有微弱表达；实验组蛋白条带灰度值为33．75±0．41，显著高于对照组的23．39±0．33（t=17．524，P=-0．013）。实验组转染后的BMSCs检测到起搏电流，并能被CsCl完全阻断，符合起搏电流特点。结论重组LVs介导HCN4基因成功转染大鼠BMSCs，并检测到HCN4蛋白表达及起搏电流。

关键词：超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4 BMSCs 慢病毒转染起搏电流

TBX3及TBX18在人源诱导多能干细胞向窦房结样细胞富集分化中的作用

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中国修复重建外科杂志 2019年第4期33卷 497-506页

作者：刘锋方易冰熊琪罗良琴周锐廖斌西南医科大学附属医院心脏大血管外科四川泸州646000 西南医科大学附属医院普胸外科四川泸州646000 西南医科大学心血管医学研究所四川泸州646000

目的探索过表达TBX3、TBX18在人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,HiPS)向窦房结样细胞富集分化的作用。方法取HiPS,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测其干性标记物OCT3/4、SOX2、NANOG表达,并与人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)比较;免疫荧光染色观察HiPS干性标记物OCT3/4、NANOG、SSEA4和TRA-1-60表达。将HiPS向心肌细胞定向分化,qRT-PCR检测心肌前体细胞特异性基因ISL1、NKX2-5(NK2 homeobox 5)以及心肌细胞特异标记物ACTN1、TNNT2表达,以成人心肌细胞(human adult cardiomyocytes,hACM)作为阳性对照;免疫荧光染色观察心肌前体细胞特异核转录因子NKX2-5,心肌细胞特异性收缩蛋白肌球蛋白(cardiac troponin,cTnT)、α-辅肌动蛋白(α-actinin),以及心房肌球蛋白轻链(myosin light chain 2A,MLC-2A)和心室肌球蛋白轻链(myosin light chain 2V,MLC-2V)表达;流式细胞术检测α-actinin阳性率。在HiPS向心肌细胞定向分化第3天(中胚层阶段),以慢病毒方式过表达窦房结相关基因TBX3、TBX18,继续培养至21 d,采用qRT-PCR检测窦房结细胞特异性标记物TBX3、TBX18、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1相对表达量,以增强绿色荧光蛋白空白病毒为对照。结果 OCT3/4、SOX2、NANOG在HiPS和ESCs中均高表达,各基因相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);OCT3/4和NANOG在HiPS中特异分布于细胞核中,SSEA4和TRA-1-60分布于细胞膜上。HiPS向心肌细胞分化5、7、21、28 d时ISL1基因以及分化7、21、28 d时NKX2-5基因相对表达量均显著高于hACM(P0.05)。过表达TBX18组中,各基因相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HiPS和hESCs的多能性相近,建立了稳定的HiPS干性维持及培养方法;成功建立HiPS向心肌细胞高效分化技术平台;尽管TBX3、TBX18在HiPS向窦房结样细胞富集分化中的促进作用不显著,但TBX3呈现出一定促进趋势,未来可进一步探索。

关键词：人诱导多能干细胞 TBX3 TBX18 窦房结样细胞

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心肌组织工程种子细胞的研究进展

西南军医 2010年第6期12卷 1156-1157页

作者：方易冰廖斌泸州医学院附属医院胸外科四川646000

目的综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题,并展望其前景。方法广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献,并进行综述。结果心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景,但还处于起步阶段,仍然需要通过大量的实验... 详细信息

目的综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题,并展望其前景。方法广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献,并进行综述。结果心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景,但还处于起步阶段,仍然需要通过大量的实验找到最佳的细胞来源。结论组织工程心肌有广阔潜在的临床应用前景,其细胞来源值得进一步研究。

关键词：心肌组织工程种子细胞

微小RNA在小鼠窦房结与心房肌、心室肌表达差异性的研究

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中国修复重建外科杂志 2014年第9期28卷 1139-1144页

作者：方易冰文智邓明彬赖前成于风旭唐小军伍长学牟光容廖斌泸州医学院附属医院心胸外科四川泸州646000 成都市第二人民医院胸外科

目的通过分析昆明小鼠窦房结与心房肌、心室肌中差异表达的微小RNA（microRNA，miRNA），探讨参与调控向窦房结细胞分化的miRNA。方法60～90日龄健康昆明小鼠190只，雌雄不限，体重35～45g。取其中10只经预实验确认窦房结解剖定位方法... 详细信息

目的通过分析昆明小鼠窦房结与心房肌、心室肌中差异表达的微小RNA（microRNA，miRNA），探讨参与调控向窦房结细胞分化的miRNA。方法60～90日龄健康昆明小鼠190只，雌雄不限，体重35～45g。取其中10只经预实验确认窦房结解剖定位方法后，切取余180只小鼠窦房结及左心耳（心房肌）、心尖处（心室肌）组织。取标本行HE染色观察；提取总RNA进行基因芯片分析，筛选差异表达miRNA，并进行基因功能关联性分析。结果小鼠窦房结解剖定位以界沟为纵轴线，上腔静脉与右心房交界处2．0mm×1．5mm×1．0mm范围；HE染色示窦房结组织细胞少，几乎无横纹，细胞质淡染，细胞核大而圆，细胞周围较多纤维结缔组织，其间可见窦房结动脉。基因芯片检测结果显示窦房结与心室肌、心房肌相比，差异表达miRNA共39个，其中上调miRNA12个，下调miRNA27个。根据靶基因构建差异miRNA与靶基因的调控网络，可得到网络中起核心调控作用的miRNA和被miRNA调控的关键靶基因。结论小鼠窦房结组织存在的差异表达miRNA可能参与了胚胎干细胞向窦房结细胞分化过程的调控。

关键词：微小RNA 差异表达基因窦房结心房肌心室肌小鼠

三分支主动脉弓覆膜支架在Stanford-A型主动脉夹层手术的应用体会

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西南军医 2014年第1期16卷 37-39页

作者：方易冰于凤旭泸州医学院附属医院心胸外科四川泸州646000

目的：总结新型三分支主动脉弓覆膜支架治疗Stanford-A型主动脉夹层的临床应用经验，评价其安全性和疗效。方法对我科2009年3月~2011年3月应用三分支主动脉弓覆膜支架治疗Stanford-A型主动脉夹层10例患者的临床资料进行分析。结果本组... 详细信息

目的：总结新型三分支主动脉弓覆膜支架治疗Stanford-A型主动脉夹层的临床应用经验，评价其安全性和疗效。方法对我科2009年3月~2011年3月应用三分支主动脉弓覆膜支架治疗Stanford-A型主动脉夹层10例患者的临床资料进行分析。结果本组患者无1例死亡，手术过程顺利，脑及右上肢停循环6～7 min，左上肢及降主动脉停循环29～40 min，心肌血运阻断时间90～106 min，体外循环时间135～200 min。术后64排CTA显示2例左锁骨下动脉支架外左侧少量血流流向降主动脉，3个月时已经消失；二次开胸止血2例，与血管吻合无关。术后1周及3个月CTA显示支架血管位置满意，各头臂血管血流通畅。结论三分支主动脉弓覆膜支架术中置入治疗A型主动脉夹层具有操作简单、并发症少、临床效果好等优点，值得临床推广应用。

关键词：主动脉夹层 Stanford A型三分支覆膜支架

Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化作用的研究进展

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泸州医学院学报 2013年第2期36卷 189-191页

作者：文静方易冰曾晓荣泸州医学院心肌电生理研究室泸州医学院附属医院心胸外科四川泸州646000

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是成体干细胞的一种，具有来源丰富，容易分离及培养，分化和增殖能力强，免疫原性低、可自体移植等优点，已被作为“种子细胞”广泛应用于组织工程、细胞治疗和基因治疗... 详细信息

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是成体干细胞的一种，具有来源丰富，容易分离及培养，分化和增殖能力强，免疫原性低、可自体移植等优点，已被作为“种子细胞”广泛应用于组织工程、细胞治疗和基因治疗的研究中。

关键词：骨髓间充质干细胞分化作用 Wnt信号通路心肌细胞 cells 成体干细胞增殖能力免疫原性

覆膜支架主动脉腔内修复术治疗创伤性主动脉破裂

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中华创伤杂志 2013年第3期29卷 211-215页

作者：杨帆杨建于风旭廖斌邓明彬康慧方易冰泸州医学院附属医院胸心外科 646000 四川大学华西医院胸心血管外科

目的探讨覆膜支架主动脉腔内修复术（endovascularaoicrepair，EVAR）治疗创伤性胸主动脉损伤（traumaticthoracicaorticinjuries，1TrAI）的可行性和有效性。方法回顾性分析13例TFAI患者的临床资料，术前螺旋CT血管造影（CTA）对病变... 详细信息

目的探讨覆膜支架主动脉腔内修复术（endovascularaoicrepair，EVAR）治疗创伤性胸主动脉损伤（traumaticthoracicaorticinjuries，1TrAI）的可行性和有效性。方法回顾性分析13例TFAI患者的临床资料，术前螺旋CT血管造影（CTA）对病变进行评估，术中数字减影血管造影（DSA）进一步评估及行EVAR。术后3，6，12个月以及其后每年随访CTA明确治疗效果。结果13例行EVAR均获成功。完全或部分遮蔽左锁骨下动脉4例，支架释放后即刻造影发现内漏3例，加短支架2次覆盖后内漏消失l例，行球囊扩张贴附后内漏明显减少1例，另1例微小内漏予观察随访。共12例获随访，无内漏、左上肢缺血、截瘫以及支架移位等并发症。结论EVR治疗TYAI安全性高，效果满意。

关键词：支架主动脉胸主动脉破裂