TBX3及TBX18在人源诱导多能干细胞向窦房结样细胞富集分化中的作用

作     者：刘锋 方易冰 熊琪 罗良琴 周锐 廖斌 LIU Feng;FANG Yibing;XIONG Qi;LUO Liangqin;ZHOU Rui;LIAO Bin

作者机构：西南医科大学附属医院心脏大血管外科四川泸州646000 西南医科大学附属医院普胸外科四川泸州646000 西南医科大学心血管医学研究所四川泸州646000 

出 版 物：《中国修复重建外科杂志》 (Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery)

年 卷 期：2019年第33卷第4期

页      面：497-506页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主　　题：人诱导多能干细胞 TBX3 TBX18 窦房结样细胞 

摘      要：目的探索过表达TBX3、TBX18在人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,HiPS)向窦房结样细胞富集分化的作用。方法取HiPS,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测其干性标记物OCT3/4、SOX2、NANOG表达,并与人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)比较;免疫荧光染色观察HiPS干性标记物OCT3/4、NANOG、SSEA4和TRA-1-60表达。将HiPS向心肌细胞定向分化,qRT-PCR检测心肌前体细胞特异性基因ISL1、NKX2-5(NK2 homeobox 5)以及心肌细胞特异标记物ACTN1、TNNT2表达,以成人心肌细胞(human adult cardiomyocytes,hACM)作为阳性对照;免疫荧光染色观察心肌前体细胞特异核转录因子NKX2-5,心肌细胞特异性收缩蛋白肌球蛋白(cardiac troponin,cTnT)、α-辅肌动蛋白(α-actinin),以及心房肌球蛋白轻链(myosin light chain 2A,MLC-2A)和心室肌球蛋白轻链(myosin light chain 2V,MLC-2V)表达;流式细胞术检测α-actinin阳性率。在HiPS向心肌细胞定向分化第3天(中胚层阶段),以慢病毒方式过表达窦房结相关基因TBX3、TBX18,继续培养至21 d,采用qRT-PCR检测窦房结细胞特异性标记物TBX3、TBX18、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1相对表达量,以增强绿色荧光蛋白空白病毒为对照。结果 OCT3/4、SOX2、NANOG在HiPS和ESCs中均高表达,各基因相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05);OCT3/4和NANOG在HiPS中特异分布于细胞核中,SSEA4和TRA-1-60分布于细胞膜上。HiPS向心肌细胞分化5、7、21、28 d时ISL1基因以及分化7、21、28 d时NKX2-5基因相对表达量均显著高于hACM(P0.05)。过表达TBX18组中,各基因相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 HiPS和hESCs的多能性相近,建立了稳定的HiPS干性维持及培养方法;成功建立HiPS向心肌细胞高效分化技术平台;尽管TBX3、TBX18在HiPS向窦房结样细胞富集分化中的促进作用不显著,但TBX3呈现出一定促进趋势,未来可进一步探索。