检索结果-南通市图书馆

毒力岛基因ibeT缺失的E.coliK1的构建及其对HBMEC侵袭力的研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

毒力岛基因ibeT缺失的E.coliK1的构建及其对HBMEC侵袭力的研究

作者：方文刚中国医科大学

学位级别：硕士

目的新生儿脑膜炎是中枢神经系统较常见的感染性疾病,在新生儿时期的大肠杆菌性脑膜炎中80%以上是由E.coli K1引起的,首先是细菌侵入血流引起菌血症,然后通过血行播散通过血脑屏障进入脑组织。血脑屏障（blood-brain barrie... 详细信息

目的新生儿脑膜炎是中枢神经系统较常见的感染性疾病,在新生儿时期的大肠杆菌性脑膜炎中80%以上是由E.coli K1引起的,首先是细菌侵入血流引起菌血症,然后通过血行播散通过血脑屏障进入脑组织。血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）介于血液和脑神经细胞之间,它能够阻止大分子物质及病原体进入脑组织,起到保护的作用。构成血脑屏障的主要部分是人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelia cells,HBMEC）,他们之间的连接是紧密连接。人们已经成功地从小鼠,大鼠,牛及人脑分离培养出了微血管内皮细胞。根据观察,E.coli K1对转染的HBMEC和原始的HBMEC的侵袭力无差异,可以作为试验模型而用于研究。研究者用比较功能基因组学方法,将E.coli K1株RS218和非致病性的E.coli K12株MG1655的全基因组对比分析,从中鉴定了23个大于10（?）且K12中没有的基因组岛。这些基因组岛在E.coli K1致病过程中起重要作用,我们将其称为毒力岛。 ibeT是E.coli K1的毒力岛基因之一,它参与E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞（HBMEC）进入血脑屏障内,为了探讨ibeT基因在E.coli K1侵袭人脑血管内皮细胞中的作用,本研究尝试构建并鉴定缺失毒力岛基因ibeT的侵袭性大肠杆菌E44的基因缺失株,并观察ibeT基因缺失株大肠杆菌对HBMEC的侵袭力变化,这对今后的临床治疗有重要意义。侵袭性大肠杆菌E44是从新生儿脑膜炎患者脑脊液中分离培养出的侵袭性E.coli K1突变株,具有利福平耐药性。方法 1、查找基因组文库,使用Primer5软件设计引物,用PCR方法扩增出ibeT基因上游片段（A）和下游片段（B）。 2、运用基因重组方法,以毒力岛基因ibeT上游片段（A）和下游片段（B）的部分序列作为同源序列的两侧序列。 3、以pCVD442作为载体,构建含有相互连接的上游片段（A）和下游片段（B）的重组自杀质粒pCVD442AB。 4、以野生型大肠杆菌E44为研究对象,通过接合转移和同源重组,利用氨卞抗性和利福平抗性筛选,构建缺失毒力岛基因ibeT的基因缺失株大肠杆菌。 5、以不同浓度两株大肠杆菌与HBMEC共培养,计数野生型大肠杆菌和基因缺失株大肠杆菌侵入HBMEC的个数。 6、用罗丹明标记的毒伞素染细胞骨架,用DAPI染细胞核,荧光显微镜观察细胞骨架的变化,同时观察两个菌株侵入HBMEC的个数。结果 1、通过PCR扩增和测序分析,大肠杆菌E44的毒力岛基因ibeT缺失。 2、两株细菌都能侵入到HBMEC内部。ibeT缺失株E44与野生型E44相比,侵入到HBMEC内部的个数明显下降,经过统计学分析,有显著性差异（p＜0.05）。结论 1、成功构建了缺失毒力岛基因ibeT的侵袭性大肠杆菌E44的基因缺失株。 2、毒力岛基因ibeT的存在,使大肠杆菌E44侵袭HBMEC的侵袭力增加。

关键词：人脑微血管内皮细胞血脑屏障毒力岛侵袭同源重组

利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基础医学与临床 2012年第2期32卷 226-232页

作者：王淳方文刚李波辽宁中医药大学基础医学院卫生生物教研室辽宁沈阳110032 中国医科大学基础医学院发育生物教研室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA(shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒;将线性化的重组... 详细信息

目的利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA(shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒;将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组;将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度。病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定。结果成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttle-scramble和AD-shuttle)。经过HEK 293细胞包装,最终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011。NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100%;且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P<0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P<0.01)。结论携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默。

关键词： RNA干扰 shRNA 腺病毒载体悬浮细胞

大鼠海马内注射β淀粉样蛋白诱导外周血T细胞MIP-1α过表达及其穿过血脑屏障

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

生物化学与生物物理进展 2006年第12期33卷 1177-1182页

作者：郭大文马怡然方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

为观察脑内β淀粉样蛋白(amyloidbeta,Aβ)沉积对外周血T细胞穿过血脑屏障的影响,通过立体定位仪将Aβ1～42肽注射到大鼠双侧海马(以Aβ42～1反序列肽为对照),实时定量PCR(RT-qPCR)检测发现,Aβ1～42上调了外周血T细胞中巨嗜细胞炎症蛋... 详细信息

为观察脑内β淀粉样蛋白(amyloidbeta,Aβ)沉积对外周血T细胞穿过血脑屏障的影响,通过立体定位仪将Aβ1～42肽注射到大鼠双侧海马(以Aβ42～1反序列肽为对照),实时定量PCR(RT-qPCR)检测发现,Aβ1～42上调了外周血T细胞中巨嗜细胞炎症蛋白(macrophageinflammatoryprotein-1α,MIP-1α)的表达,同时免疫荧光分析显示,脑内的Aβ1～42也引起了脑微血管内皮上MIP-1α受体(CCR5)的表达增加,以及伴随的脑实质内T细胞数量的增加.然而,大鼠腹腔内注射抗MIP-1α中和抗体则阻断了Aβ1～42所致的脑内T细胞数量的增加.提示脑内Aβ沉积能诱导外周血T细胞MIP-1α依赖性迁移入脑.

关键词：阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 MIP-1α T细胞血脑屏障

糖调节蛋白Grp78在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达及意义

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国医科大学学报 2004年第1期33卷 70-71,74页

作者：王孟春方文刚陈澄李岩中国医科大学附属第二医院内窥镜中心辽宁沈阳110004 中国医科大学基础医学院发育生物学教研室

目的 :了解葡萄糖调节蛋白Grp78在幽门螺杆菌 (HP)感染人胃黏膜组织中的表达情况。方法 :应用半定量RT PCR及Westernblotting方法检测人胃黏膜组织中Grp78mRNA及蛋白的表达。结果 :HP未感染组 2 8例 ,Grp78mRNA表达为 0 .80 3 8± 0 .0... 详细信息

目的 :了解葡萄糖调节蛋白Grp78在幽门螺杆菌 (HP)感染人胃黏膜组织中的表达情况。方法 :应用半定量RT PCR及Westernblotting方法检测人胃黏膜组织中Grp78mRNA及蛋白的表达。结果 :HP未感染组 2 8例 ,Grp78mRNA表达为 0 .80 3 8± 0 .0 50 0 ,感染组 3 2例 ,Grp78mRNA表达为 1.1586± 0 .0 83 9;未感染组Grp78蛋白表达为 0 .43 4 5± 0 .0 545,感染组Grp78蛋白表达为 0 .62 0 4± 0 .0 412。两组相比差异显著 (P <0 .0 1)。结论 :正常胃黏膜组织有Grp78mRNA的表达及蛋白的合成。HP感染胃黏膜增加Grp78mRNA的表达及蛋白的合成。

关键词：糖调节蛋白幽门螺杆菌

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

科学通报 2005年第4期50卷 340-343页

作者：尚德淑方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

ibeB 是一个致脑膜炎大肠杆菌 K1 株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以 ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经 ibeB... 详细信息

ibeB 是一个致脑膜炎大肠杆菌 K1 株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以 ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经 ibeB 基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP 标记的活细胞观察显示外源性 IbeB 蛋白定位于细胞核. 上述结果提示 ibeB基因可能在调控 nestin 表达过程中发挥功能, 这为研究 nestin 基因的表达调控提供了资料.

关键词： B基因鼠胚转染胚胎干细胞脑微血管内皮细胞侵袭分化表达调控活细胞蛋白定位

毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

生物化学与生物物理进展 2009年第4期36卷 417-423页

作者：张可赵伟东李强方文刚朱莉陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌.为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮... 详细信息

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌.为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长.利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆菌的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少.利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低.这些结果提示,在大肠杆菌K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制.

关键词： ibeT 大肠杆菌K1株人脑微血管内皮细胞溶酶体逃逸

大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白-yijP的表达纯化

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国医科大学学报 2005年第1期34卷 16-18页

作者：王淳方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学研究室

目的:研究大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物在大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞中的作用,以期阐明大肠杆菌穿过血脑屏障的机制。方法:应用PCR方法获取yijP基因C末端 1. 04kb片断(编码333个氨基酸),将其克隆到PQE载体并转化... 详细信息

目的:研究大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物在大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞中的作用,以期阐明大肠杆菌穿过血脑屏障的机制。方法:应用PCR方法获取yijP基因C末端 1. 04kb片断(编码333个氨基酸),将其克隆到PQE载体并转化到受体菌M15,以构建出表达N 末端带有 6个组氨酸的yijP融合蛋白的工程菌。通过Ni NTAAgarose亲和层析法提纯yijP融合蛋白,初步分析该蛋白对人脑微血管内皮细胞 (HB -MEC)生长的影响。结果:成功获得了分子量为 41kd的yijP融合蛋白,并发现yijP蛋白对HBMEC有较强的细胞毒作用。结论:大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物 yijP蛋白可能是一种细胞毒因子。

关键词：大肠杆菌人脑微血管内皮细胞血脑屏障 yijP基因

纳米线电卡效应的表面应力与固溶改性相场模拟

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

物理学报 2024年第10期73卷 50-58页

作者：邹幸朱哲方文啸湘潭大学材料科学与工程学院湘潭411100 中山大学集成电路学院深圳518107

以铁电纳米线为填料的复合薄膜表现出了满足固态制冷需求的高绝热温变,其平行分布填充的纳米线因和传统垂直分布的取向不同,被认为是获得大电卡效应的关键因素,然而其大电卡效应的内在机理尚不十分明确.因此本文以PbTiO_(3)纳米线为研... 详细信息

以铁电纳米线为填料的复合薄膜表现出了满足固态制冷需求的高绝热温变,其平行分布填充的纳米线因和传统垂直分布的取向不同,被认为是获得大电卡效应的关键因素,然而其大电卡效应的内在机理尚不十分明确.因此本文以PbTiO_(3)纳米线为研究对象,建立平行分布纳米线模型,通过相场模拟研究表面应力和固溶改性对其电卡效应的影响.结果表明,表面应力和固溶改性能够分别调控纳米线相变温度并获取大的绝热温变,并最终实现了在600 kV/cm电场下,0-300℃的宽温度区间获得大于6 K绝热温变的效果.同时结合三维畴结构的演变,揭示了诱发不同畴翻转类型是平行分布纳米线结构获得大电卡效应的内在机理.通过本研究为基于平行分布铁电纳米线电卡效应的固态制冷技术发展提供了有益的理论指导.

关键词：电卡效应纳米线表面应力固溶改性

PLGF通过激活Rho/ROCK信号通路介导人脑微血管内皮细胞间紧密连接开放

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

基础医学与临床 2013年第8期33卷 960-965页

作者：王淳李波方文刚陈誉华辽宁中医药大学基础医学院卫生生物教研室辽宁沈阳110032 中国医科大学基础医学院发育生物教研室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的探讨胎盘生长因子(PLGF)影响人脑微血管内皮细胞(HBMEC)间通透性的分子机制。方法利用HBMEC构建体外血脑屏障模型,测定跨内皮细胞电阻抗(TEER)及检测HRP通过率,分析PLGF对血脑屏障完整性的影响;用Western blot法及免疫荧光法检测HB... 详细信息

目的探讨胎盘生长因子(PLGF)影响人脑微血管内皮细胞(HBMEC)间通透性的分子机制。方法利用HBMEC构建体外血脑屏障模型,测定跨内皮细胞电阻抗(TEER)及检测HRP通过率,分析PLGF对血脑屏障完整性的影响;用Western blot法及免疫荧光法检测HBMEC间紧密连接相关蛋白质occludin和ZO-1的表达及分布,用蛋白激酶抑制剂干预和Western blot法检测Rho蛋白活性。结果 25 ng/mL PLGF 30 min显著降低体外血脑屏障模型TEER,使其通透性增高(P<0.05);增加S-occludin表达的同时降低了IS-occludin的表达,使ZO-1蛋白在细胞周边分布减少;此外,ROCK蛋白激酶抑制剂Y27632抑制了PLGF引起的体外血脑屏障透过性增高(P<0.05),并激活细胞内Rho激酶活性。结论 PLGF通过激活HBMEC内Rho/ROCK信号通路,影响HBMEC间紧密连接完整性,进而改变血脑屏障的通透性。

关键词：胎盘生长因子血脑屏障紧密连接 Rho ROCK