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鸭源鸡杆菌中国株外膜蛋白W基因鉴定及其敲除株的构建

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鸭源鸡杆菌中国株外膜蛋白W基因鉴定及其敲除株的构建

作者：敬文宪河南农业大学

学位级别：硕士

鸭源鸡杆菌是巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种,为革兰氏阴性菌。研究表明其在一定条件下能够引起蛋鸡生殖系统的损伤、腹膜炎及败血症和呼吸道疾病等,造成产蛋量下降,死亡率上升。鸭源鸡杆菌存在多重耐药性及固有抗原的多样性,这使得抗生素... 详细信息

鸭源鸡杆菌是巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种,为革兰氏阴性菌。研究表明其在一定条件下能够引起蛋鸡生殖系统的损伤、腹膜炎及败血症和呼吸道疾病等,造成产蛋量下降,死亡率上升。鸭源鸡杆菌存在多重耐药性及固有抗原的多样性,这使得抗生素及疫苗对该病的防治效果不甚理想,给养殖业带来的经济损失越来越严重。目前,鸭源鸡杆菌致病机理的研究还十分有限,仅有少数几个预测的毒力因子得到的确认,其中包括新型的RTX毒素Gtx A、多糖荚膜、金属蛋白酶和粘附素等。本试验首次针对鸭源鸡杆菌外膜蛋白W(OmpW)开展了初步研究,首先借助PCR及生物信息学方法,获得了OmpW基因在鸭源鸡杆菌中分布状态、预测了其可能存在的抗原表位,并利用鸭源鸡杆菌OmpW的原核表达产物制备多克隆抗体,对其免疫原性进行了研究。为进一步的研究OmpW基因的功能,本试验首次在国内利用靶向基因操作技术成功构建了鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因突变株Δomp W。1.鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因扩增及生物信息学分析本研究参照GenBank中公布的UMN179的OmpW基因序列,设计一对通用引物,通过PCR对32株不同来源的鸭源鸡杆菌OmpW基因进行扩增,首次对鸭源鸡杆菌OmpW基因的存在状态进行分析,并借助生物信息学方法,对Yu-PDS-RZ-1-SLG株OmpW氨基酸序列进行分析,预测其理化特性、结构特征及保守的B细胞优势抗原表位。结果显示,OmpW基因在鸭源鸡杆菌基因组中广泛存在,并具有较高的保守性;OmpW为筒状结构,其四个高变区均位于胞外;同时不同菌株具有共同的B细胞抗原表位,它们之间可能具有交叉免疫原性。本研究结果为鸭源源鸡杆菌诊断方法的建立、新型高效疫苗的研制及OmpW基因功能的研究奠定基础。2.鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因的表达及抗原性鉴定本试验应用PCR技术扩增了去信号肽的鸭源鸡杆菌OmpW基因片段,将扩增片段成功克隆到表达载体p ET-28a,转化到BL21中,并利用IPTG诱导,成功对鸭源鸡杆菌OmpW进行原核表达。将上述经纯化的表达产物免疫家兔,获得抗OmpW的多克隆抗血清,并通过Western blotting初步鉴定了其免疫原性。结果显示,重组蛋白OmpW具有良好的免疫原性,而且制备的抗OmpW多抗能够与不同的鸭源鸡杆菌发生免疫反应,这不仅表明OmpW成为具有交叉免疫保护性疫苗的潜能,而且有望基于OmpW建立鸭源鸡杆菌的血清学检测方法,同时该研究为后续OmpW基因缺失突变株的构建提供可靠的检测依据。3.鸭源鸡杆菌OmpW基因敲除株的构建本研究根据GenBank中发表的鸭源鸡杆菌OmpW基因序列的上下游基因序列设计两对上下臂引物,利用PCR方法从鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株基因组中扩增OmpW基因上游、下游同源臂,将其分别克隆至p MD18-T载体中获得重组质粒p SX,随后将氯霉素抗性盒子插入到上下游同源臂之间,从而构建了质粒p SCX。设计1对特异性引物,利用PCR方法获得SCX DNA片段,并将其通过自然转化法成功转入Yu-PDS-RZ-1-SLG株,经同源重组使氯霉素抗性盒子代替基因组中的OmpW基因,并分别通过PCR及Western Blotting在基因及蛋白水平对其进行鉴定,最终获得具有氯霉素抗性的ΔOmpW突变株。鸭源鸡杆菌ΔOmpW突变株的成功构建不仅为其OmpW的功能研究奠定了良好的基础,而且为该菌其它基因的研究将提供了更为可靠的方法。

关键词：鸭源鸡杆菌 OmpW 原核表达 ΔOmpW突变株

鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因克隆及结构与功能分析

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中国兽医学报 2017年第1期37卷 47-53页

作者：敬文宪彭志锋王新卫常洪涛刘红英王川庆卢彩景杨霞河南农业大学禽病研究所河南郑州450002

参考GenBank中鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)UMN179的外膜蛋白W(outer membrane protein W,OmpW)基因序列设计1对引物,对鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG株的OmpW基因进行克隆、测序,并通过生物信息学软件对该蛋白结构与功能进行分析及预测。结果显示:OmpW基因大小为705bp,编码234个氨基酸;与鸭源鸡杆菌UMN179株、F149株及12656/12株的OmpW氨基酸同源性分别为88.9%、78.7%和79.6%;OmpW相对分子质量为25 300,等电点为7.88,是能够稳定存在的蛋白,N端有1个疏水性的α螺旋信号肽,C端有1个疏水性的β折叠区域,并且在外膜表面存在1个保守性的B细胞线性表位。本试验成功克隆了鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG株的OmpW基因,并对其结构与功能进行初步分析和预测,为进一步研究其生物学功能及其应用奠定基础。

关键词：鸭源鸡杆菌 OmpW基因克隆结构与功能分析

鼠伤寒沙门氏菌双组分系统arcB基因缺失株的构建及药物敏感性分析

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 879-886页

作者：武珊珊敬文宪陈启伟李学瑞刘永生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为探究双组分系统arcB基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响,本研究利用Red同源重组系统构建arcB基因缺失株和arcB基因回复株以及通过无缝克隆和重组技术构建3株arcB基因关键位点点突变株。采用微量稀释法测定亲本株、arcB缺失株、回复株... 详细信息

为探究双组分系统arcB基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响,本研究利用Red同源重组系统构建arcB基因缺失株和arcB基因回复株以及通过无缝克隆和重组技术构建3株arcB基因关键位点点突变株。采用微量稀释法测定亲本株、arcB缺失株、回复株及点突变株药物敏感性和体外生长速率,初步分析双组分系统arcB基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。结果显示,经PCR测序鉴定结果表明构建了鼠伤寒沙门氏菌CVCC541ΔarcB缺失株及其回复株、arcB基因点突变株(arcB^His-292-Ala、arcB^Asp-576-Ala、arcB^His-717-Ala)。生长曲线测定结果显示:缺失株、点突变株和亲本株相比生长速率降低,回复株生长速率回复,与亲本株生长曲线一致;MIC测定结果显示:与亲本株相比,arcB基因缺失株对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素的敏感性无变化,但对氨基糖苷类的链霉素、阿米卡星、庆大霉素的耐药性分别增加16、8、4倍;基于该结果测定的各菌株对氨基糖苷类抗生素的MIC结果显示:与亲本株相比,arcB基因缺失株对链霉素、妥布霉素、庆大霉素的耐药性增加8倍,对阿米卡星、新霉素、奈替米星、卡那霉素的耐药性增加4倍,对大观霉素的敏感性未发生变化;而回复株与亲本株药物敏感性相似;arcB基因关键位点突变株的药物敏感性与arcB基因缺失株一致。以上结果表明,arcB基因参与鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素耐药性的调控。上述实验结果为深入研究双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌的耐药机制提供实验依据。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌双组分系统 arcB基因药物敏感性

鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因敲除及其功能特性

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微生物学报 2020年第8期60卷 1683-1695页

作者：王志林董震武珊珊敬文宪陈启伟尚佑军王琬凝刘永生兰喜中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 华南农业大学动物医学院广东省重大临床动物疾病预防控制重点实验室广东广州510642 甘肃省定西市安定区畜牧兽医局甘肃定西743000

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是大多数革兰氏阴性细菌中都存在的一种重要的分泌系统,能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用,溶血素共调节蛋白(Hcp)和缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是组成T6SS穿刺装置的重要组分。但鼠伤寒沙门氏... 详细信息

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是大多数革兰氏阴性细菌中都存在的一种重要的分泌系统,能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用,溶血素共调节蛋白(Hcp)和缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是组成T6SS穿刺装置的重要组分。但鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统的Hcp与VgrG在该菌入侵宿主细胞及抗吞噬过程中发挥的作用尚不十分清楚。【目的】本研究旨在利用基因敲除技术构建的鼠伤寒沙门氏菌hcp及vgrg基因缺失株体外接种真核上皮细胞和巨噬细胞,并以其亲本株作为对照,以研究Hcp及VgrG在该菌粘附、侵入上皮细胞及抗吞噬过程中所发挥的作用。【方法】通过优化Red同源重组系统操作过程中各个条件,建立一套快速敲除鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因的操作系统,成功构建鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的hcp及vgrg单基因缺失株、双基因缺失株及三基因缺失株,并用Hela细胞接种试验和菌落计数试验,评估不同菌株的粘附和侵袭能力;用小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种试验,评估不同菌株的抗吞噬能力。【结果】与亲本株CVCC541粘附侵袭Hela细胞相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的粘附率分别为17.17%±2.1%、14.73%±2.5%和82%±3.7%;CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的侵袭率分别为7.05%±1.05%、6.21%±1.35%和87%±3.25%;与亲本株CVCC541在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的存活相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的存活率分别为15.67%±2.9%、14.47%±1.87%和56.12%±3.48%。【结论】鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统VgrG和Hcp对该菌入侵细胞和抗吞噬方面具有重要作用,该研究为鼠伤寒沙门氏菌通过六型分泌系统与宿主细胞相互作用的机制研究奠定了基础。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌 Ⅵ型分泌系统(T6SS) 溶血素共调节蛋白(Hcp) 缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG) Red同源重组系统

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鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞作用

中国兽医学报 2016年第2期36卷 228-233,239页

作者：张秀平卢彩景陈陆李永涛刘红英彭志锋敬文宪杨霞王川庆河南农业大学禽病研究所河南郑州450002

为研究鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的作用,分别以细菌黏附、侵袭试验及借助姬姆萨染色及扫描电镜观察2株不同来源的鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的黏附和侵袭特性。黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附输卵管上皮细... 详细信息

为研究鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的作用,分别以细菌黏附、侵袭试验及借助姬姆萨染色及扫描电镜观察2株不同来源的鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的黏附和侵袭特性。黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附输卵管上皮细胞,而菌株F149T对输卵管上皮细胞有较低的黏附。庆大霉素保护试验结果显示2株菌对输卵管上皮细胞均无可见侵袭力。姬姆萨染色及扫描电镜试验进一步证明输卵管上皮细胞表面有细菌黏附,而内部未见有侵袭的细菌,但Yu-PDS-RZ-1-SLG株接种细胞90min后,细胞逐渐破碎脱落,而菌株F149T则未见明显细胞损伤。菌株经胰蛋白酶处理后,细菌的黏附率显著降低,表明细菌的表面蛋白参与黏附。ELISA法检测鸭源鸡杆菌感染输卵管上皮细胞后炎性细胞因子的变化,结果表明感染组的IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均高于对照组,且Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的细胞所分泌的各细胞因子均高于F149T,提示炎性细胞因子的分泌可能改变局部的微环境,促进细菌在输卵管细胞表面增殖,是造成输卵管上皮细胞损伤的机制之一。

关键词：鸭源鸡杆菌原代输卵管上皮细胞黏附和侵袭细胞毒性细胞因子

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鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性

畜牧兽医学报 2015年第2期46卷 295-302页

作者：张秀平陈陆赵军王川庆李永涛刘红英彭志锋卢彩景敬文宪杨霞河南农业大学禽病研究所郑州450002

为研究鸭源鸡杆菌(G.anatis)体外黏附和侵袭细胞的能力,选择HeLa细胞为感染模型,分别以细菌黏附和侵袭HeLa细胞数量为指标,借助革兰和姬姆萨染色及电镜观察来研究2株不同来源的鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性。结果显示:黏附计... 详细信息

为研究鸭源鸡杆菌(G.anatis)体外黏附和侵袭细胞的能力,选择HeLa细胞为感染模型,分别以细菌黏附和侵袭HeLa细胞数量为指标,借助革兰和姬姆萨染色及电镜观察来研究2株不同来源的鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性。结果显示:黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附HeLa细胞,菌株感染30、60、90、120、150min后每细胞黏附的细菌数分别为0.84、4.68、8.52、9.27、8.2个,而菌株F149T对HeLa细胞有较低的黏附作用。侵袭试验表明Yu-PDS-RZ-1-SLG有低度侵袭力,侵袭的细菌数在150min时达到最大,约8.27·1 000细胞-1,随后细胞破碎,细胞逐渐脱落,而菌株F149T未检测到侵袭力。染色及电镜试验进一步证实鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG可黏附于HeLa细胞表面并侵入细胞内部。菌株经胰蛋白酶处理后,细菌的黏附率显著降低,表明细菌的表面蛋白参与黏附。黏附和入侵特性是鸭源鸡杆菌定殖在组织表面重要的能力,该细胞模型的建立为进一步研究其致病机制提供了条件。

关键词：鸭源鸡杆菌细胞黏附细胞侵袭 HeLa细胞

鸭源鸡杆菌ompW基因缺失菌株的构建及其药物敏感性分析

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畜牧兽医学报 2017年第7期48卷 1306-1313页

作者：彭志锋崔丹丹杨霞敬文宪王忠田王坤芃王川庆河南农业大学禽病研究所郑州450002 中国兽医药品监察所北京100086

探索OmpW在鸭源鸡杆菌耐药性形成中的作用。运用M-IV培养基诱导鸭源鸡杆菌自然感受态细胞,用含有氯霉素抗性(Cmpr)筛选标记和同源臂的线性DNA打靶片段替换目的基因;以PCR、SDS-PAGE及Western blot鉴定阳性转化子ΔompW。通过微量稀释法... 详细信息

探索OmpW在鸭源鸡杆菌耐药性形成中的作用。运用M-IV培养基诱导鸭源鸡杆菌自然感受态细胞,用含有氯霉素抗性(Cmpr)筛选标记和同源臂的线性DNA打靶片段替换目的基因;以PCR、SDS-PAGE及Western blot鉴定阳性转化子ΔompW。通过微量稀释法测定12种抗菌药物对鸭源鸡杆菌亲本菌株RU和突变株ΔompW的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:鸭源鸡杆菌阳性转化子缺失了ompW,成功构建了ompW缺失突变菌株ΔompW;相对于RU,土霉素和四环素对ΔompW的MIC值分别降低到1/8(16/128,P<0.01)和1/32(4/128,P<0.01),其他药物的MIC值无明显变化。本研究首次利用自然转化法构建了鸭源鸡杆菌ompW缺失菌株ΔompW;OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用。

关键词：鸭源鸡杆菌 OmpW 突变菌株抗菌药物 MIC

猪源屎肠球菌致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性分析

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中国预防兽医学报 2014年第5期36卷 350-353页

作者：卢彩景张秀平陈陆赵军王新卫敬文宪常洪涛刘红英姚慧霞王川庆杨霞河南农业大学禽病研究所河南郑州450002

为研究猪源屎肠球菌的致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性,本研究分别对9株猪源屎肠球菌进行动物试验、药敏试验和生物被膜形成能力的测定。结果显示有66.67%的菌株引起小鼠肝脏、脾脏出血等病变,并且其中部分菌株导致接种小鼠... 详细信息

为研究猪源屎肠球菌的致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性,本研究分别对9株猪源屎肠球菌进行动物试验、药敏试验和生物被膜形成能力的测定。结果显示有66.67%的菌株引起小鼠肝脏、脾脏出血等病变,并且其中部分菌株导致接种小鼠急性的高死亡率;9株屎肠球菌中KF-QX-1株耐药率最高为100%,其次为ZKXH01(95.24%)、NY01(90.48%)、NY-XY-4(80.95%)、SBLH(76.19%)、HUAX(71.43%)、NY-XY-1(71.43%)和ZHENGY(66.67%),耐药率低于50%的菌株只有JY02(14.29%);生物被膜检测结果显示9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力,其中2株菌(JY02和NY-XY-1)生物被膜形成能力相对较强;通过对上述试验结果综合分析显示,肠球菌菌株对受试动物的致病力与其耐药性和生物被膜形成能力之间缺乏明显的相关性,但具有生物被膜形成及耐药两种特性会增强猪源肠球菌的耐药性和传播性,给人类和动物的疾病控制造成更大的威胁。

关键词：肠球菌致病力耐药性生物被膜相关性

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鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因扩增及序列分析

黑龙江农业科学 2017年第5期 6-11页

作者：王继洋王坤芃敬文宪王艳彭志锋杨霞河南农业大学禽病研究所河南郑州450002

为了解不同鸭源鸡杆菌菌株外膜蛋白W基因(ompW)的差异性,对不同地域32株鸭源鸡杆菌ompW基因进行扩增、测序,并应用DNAstar/MegAlign和MEGA.5.05软件对其进行比对及遗传进化分析。结果表明:ompW基因存在于所有检测的鸭源鸡杆菌中。全长在... 详细信息

为了解不同鸭源鸡杆菌菌株外膜蛋白W基因(ompW)的差异性,对不同地域32株鸭源鸡杆菌ompW基因进行扩增、测序,并应用DNAstar/MegAlign和MEGA.5.05软件对其进行比对及遗传进化分析。结果表明:ompW基因存在于所有检测的鸭源鸡杆菌中。全长在630~711bp,编码209~236个氨基酸。与参考株UMN179的ompW核苷酸同源性为88.7%~100%,氨基酸同源性为86.7%~99.6%。不同来源的鸭源鸡杆菌的核苷酸同源率为84.1%~100%,氨基酸同源性为78.7%~99.6%。进化树分析表明,鸭源鸡杆菌ompW序列差异与分离地理位置,毒力无明显的相关性。

关键词：鸭源鸡杆菌 ompW 扩增序列分析