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蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立

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蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立

作者：才文道力玛内蒙古农业大学

学位级别：硕士

蒙古马是世界上最古老的马品种之一,是我国优秀的马种资源。具有耐寒耐旱、耐粗饲、适应能力强等特征。此外,马匹关节和肌腱的解剖学、生理学以及损伤性质与人类高度相似,因此马是用于研究软骨损伤或退化细胞疗法的传统动物模型之一。... 详细信息

蒙古马是世界上最古老的马品种之一,是我国优秀的马种资源。具有耐寒耐旱、耐粗饲、适应能力强等特征。此外,马匹关节和肌腱的解剖学、生理学以及损伤性质与人类高度相似,因此马是用于研究软骨损伤或退化细胞疗法的传统动物模型之一。诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）是将特定的转录因子导入体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的一类细胞。iPSCs可以来源于任意体细胞,能够自我更新并分化为所有类型体细胞,因此在生物医学上可以用于建立疾病模型,以研究疾病的发生、药物检测以及疾病治疗,而在农业方面,它还可以用于研发转基因动物或者保护优秀遗传资源。但迄今为止,尽管有许多团队尝试建立马的iPSCs,但仍没有真正的马iPSCs的报道,在国内外均没有关于蒙古马iPS细胞的研究。因此,为了建立蒙古马诱导多能干细胞系,在本研究中,我们采用多顺反子慢病毒载体,将OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个外源基因导入至蒙古马胚胎成纤维细胞中进行重编程。为后续进一步建立蒙古马生物学及医学细胞模型奠定基础。我们的实验结果如下:1.通过消化法分离培养了蒙古马34天胚胎成纤维细胞和小鼠13.5天胚胎成纤维细胞。两种细胞形态都符合成纤维细胞形态特征,能够正常消化传代,并且经过冻存、复苏后能够正常增殖且形态无异常。可以为后续研究提供重编程供体细胞及马iPSCs的饲养层。2.为了优化多顺反子慢病毒包装体系,我们使用脂质体3000和脂质体LTX两种转染试剂转染293T细胞,并比较了编码绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒的转染效率及包装病毒感染细胞的能力。最终显示,脂质体3000在病毒质粒的转染效率和包装病毒颗粒对细胞的感染能力方面都显示出较好的效果,分别为79.4±6.3%和74±3.6%。3.通过感染编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的多顺反子慢病毒,我们成功获得了蒙古马iPS样细胞（E-iPS）:⑴蒙古马iPS样细胞显示出清晰的边缘、呈细胞集落生长;⑵对蒙古马iPS样细胞进行碱性磷酸酶染色,结果呈阳性,表明其具有多能性;⑶提取蒙古马iPS样细胞RNA,实时荧光定量PCR方法检测蒙古马iPS样细胞多能性相关基因的m RNA表达水平,结果显示,蒙古马iPS样细胞高表达Oct4、Sox2、Nanog、Bmp4、Rex1等5个多能性相关基因;⑷对获得的蒙古马iPS样细胞进行免疫荧光染色实验,结果显示蒙古马iPS样细胞表达多能性标记Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、SSEA-1以及SSEA-4;⑸将蒙古马iPS细胞培养液中成分2i、LIF及BFGF撤去后观察其形态变化。结果显示,培养液撤去2i和BFGF时,E-iPS失去克隆形态,表明蒙古马iPS细胞可能通过BFGF途径来维持多能性。

关键词：诱导多能干细胞蒙古马多顺反子诱导体系细胞重编程

慢病毒包装体系的优化及其感染马胚胎成纤维细胞的研究

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黑龙江畜牧兽医 2023年第19期 13-16,136页

作者：才文道力玛伊敏娜神英超赵比力格王敏格日乐其木格芒来内蒙古农业大学动物科学学院/内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室呼和浩特010018 农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站/内蒙古农业大学马属动物研究中心呼和浩特010018

为了建立高效率的病毒包装体系,完善研究蒙古马相关基因功能的基础手段,试验采用脂质体3000和脂质体LTX两种试剂对编码绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒的转染效率和慢病毒感染效率进行比较,并使用其中转染效率和感染效率较优的脂质体进一... 详细信息

为了建立高效率的病毒包装体系,完善研究蒙古马相关基因功能的基础手段,试验采用脂质体3000和脂质体LTX两种试剂对编码绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒的转染效率和慢病毒感染效率进行比较,并使用其中转染效率和感染效率较优的脂质体进一步感染马胚胎成纤维细胞。结果表明:脂质体3000与脂质体LTX对编码绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒转染效率分别为(79.4±6.3)%和(74.6±6.2)%;脂质体3000与脂质体LTX包装病毒液后感染293T细胞的感染效率分别为(74.0±3.6)%和(69.2±3.4)%。两者之间的转染效率及感染效率均差异不显著(P>0.05),都可以有效改善病毒的感染,其中脂质体3000的应用效果更好,脂质体3000可成功感染马胚胎成纤维细胞,感染效率为(69.4±6.4)%。说明脂质体3000可以高效率包装慢病毒,并可用于感染马胚胎成纤维细胞。

关键词：慢病毒脂质体马优化成纤维细胞

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大动物多能干细胞建立研究进展

中国实验动物学报 2020年第5期28卷 695-701页

作者：才文道力玛伊敏娜王希生神英超纳日嘎陶力格日乐其木格芒来内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室呼和浩特010018 农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站内蒙古农业大学马属动物研究中心呼和浩特010018

多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)是可以无限增殖更新并具有分化为各种组织细胞潜能的一类干细胞系。而其中的iPS细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)的建立更是进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离,并且对农... 详细信息

多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)是可以无限增殖更新并具有分化为各种组织细胞潜能的一类干细胞系。而其中的iPS细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)的建立更是进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离,并且对农业经济发展和动物医学领域具有巨大的潜在应用价值。然而目前干细胞深层次的机制与应用研究主要还是集中在小鼠和人类干细胞上,而对于农牧业与兽医学关系紧密的大动物干细胞的研究主要还在初步建立与应用尝试阶段。而本文通过归纳整理相关文献,简述了胚胎多能干细胞以及诱导多能干细胞在猪、牛、马等大动物中的建立研究现状。

关键词：多能干细胞胚胎干细胞诱导性多能干细胞大动物

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马属动物卵巢发育研究进展

中国畜牧杂志 2022年第1期58卷 38-43页

作者：陶力神英超伊敏娜才文道力玛王希生任宏格日乐其木格芒来内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站内蒙古农业大学马属动物研究中心内蒙古呼和浩特010018

随着国内经济发展,马、驴产业经济价值越来越高,产业需求量也日益增长,但马属动物是繁殖周期较长的季节性单胎动物,其独特的繁殖生理结构特性成为马属动物繁殖效益和相关繁殖技术开发应用的主要因素之一。卵巢作为雌性动物生殖系统中的... 详细信息

随着国内经济发展,马、驴产业经济价值越来越高,产业需求量也日益增长,但马属动物是繁殖周期较长的季节性单胎动物,其独特的繁殖生理结构特性成为马属动物繁殖效益和相关繁殖技术开发应用的主要因素之一。卵巢作为雌性动物生殖系统中的核心器官,在神经系统和内分泌系统的作用和调节下,具有周期性产生卵子和分泌生殖激素的功能。然而由于排卵窝这一独特结构的存在,马属动物卵巢结构、发育、排卵和调控明显不同于其他家畜动物。因此,本文对国内外近些年在马属动物卵巢结构、排卵窝、卵泡分布及相关分子机理方面进行的研究进行归纳梳理,以期为在国内重启马属动物繁殖机理与技术研究提供理论帮助。

关键词：马属动物卵巢发育排卵窝卵泡分布

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睾丸支持细胞的功能、分离纯化及鉴定研究进展

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中国畜牧兽医 2021年第8期48卷 2947-2956页

作者：伊敏娜才文道力玛陶力王希生神英超杜明任宏芒来格日乐其木格内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室呼和浩特010018

支持细胞对维持精子形成过程中的微环境起决定作用,它可以通过分泌功能、细胞间连接形成的血睾屏障功能以及吞噬功能等来促进精子的形成过程,其发育异常会导致不同程度的雄性生殖缺陷。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,体外培... 详细信息

支持细胞对维持精子形成过程中的微环境起决定作用,它可以通过分泌功能、细胞间连接形成的血睾屏障功能以及吞噬功能等来促进精子的形成过程,其发育异常会导致不同程度的雄性生殖缺陷。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,体外培养高纯度支持细胞可成为研究睾丸两大核心功能—精子发生和性激素分泌功能相关调节机制重要的细胞模型。此外,体外培养睾丸支持细胞也可作为生殖毒理学等新兴热点领域的细胞模型,为评估和研究环境因素对雄性生殖的影响提供便利。因此,作者系统地归纳、总结了目前关于动物支持细胞生物功能的研究及常用的体外分离纯化、培养及鉴定方法,以期为利用动物支持细胞开展雄性生殖领域的研究提供参考。

关键词：支持细胞功能分离纯化体外培养鉴定

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马骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定

马骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定

蒙古马胎儿成纤维细胞永生化细胞体系建立的研究

第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：张心壮赵雅丽才文道力玛格日乐其木格芒来内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室内蒙古农业大学马属动物研究中心

引言马在运动过程中产生的大量氧自由基会引起肌细胞膜结构和渗透性的改变,导致肌细胞泄漏,造成肌肉损伤。骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs)是研究肌肉生长和发育机制的重要模型,有助于识别和更好地研究哺乳动物肌肉的生长发育、损... 详细信息

引言马在运动过程中产生的大量氧自由基会引起肌细胞膜结构和渗透性的改变,导致肌细胞泄漏,造成肌肉损伤。骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs)是研究肌肉生长和发育机制的重要模型,有助于识别和更好地研究哺乳动物肌肉的生长发育、损伤修复。本实验通过建立马骨骼肌卫星细胞的体外分离培养体系,为相关研究提供了基础实验细胞模型。

关键词：肌肉损伤骨骼肌卫星细胞肌纤维标志基因分离培养

来源： cnki会议评论

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中国畜牧兽医 2023年第1期50卷 46-57页

作者：田书岳神英超王希生王敏伊敏娜才文道力玛陶力赵毕力格芒来格日乐其木格内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站马属动物研究中心呼和浩特010018

【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts,EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-I... 详细信息

【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts,EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs,经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs,以第3代EFFs为对照,采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平,CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分(TERC)序列相似性。【结果】原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代,但第17代细胞发生了衰老。hTERT基因可成功转入EFFs,并至少稳定表达20代。然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs(P<0.05),hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs(P<0.05)。细胞衰老检测结果表明,hTERT-EFFsβ-半乳糖苷酶染色呈阳性。序列相似性比对结果显示,马TERT与hTERT mRNA保守性较高,相似性为73.2%;马TERT与hTERT蛋白保守性较其他物种高,相似性为76.3%,表明马TERT与hTERT在结构和功能上是高度相似;马TERC与人TERC相似性较高,在进化树上位于同一分支,但马TERC与TERT的结合及与端粒酶活性相关的关键核苷酸中存在突变。【结论】单独过表达hTERT可以延长EFFs体外传代次数不超过30代,但仍不足以使蒙古马EFFs细胞高质量永生化,这可能与hTERT与eTERC不相容有关。

关键词：蒙古马马胎儿成纤维细胞(EFFs) 永生化人端粒酶逆转录亚基(hTERT) 细胞增殖

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睾丸组织切片制作及蒙古马睾丸支持细胞血睾屏障的体外培养研究

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睾丸组织切片制作及蒙古马睾丸支持细胞血睾屏障的体外培养研究

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第二十次学术研讨会

作者：伊敏娜才文道力玛陶力王希生神英超杜明任宏芒来格日乐其木格内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室

引言动物睾丸中支持细胞通过产生血睾屏障、分泌因子以及吞噬细胞等功能来参与和保障精子的形成过程,随着支持细胞的成熟,相邻的支持细胞可通过建立由紧密连接、粘附连接和缝隙连接为主的血睾屏障形成免疫屏障,将机体的免疫系统和精子...

引言动物睾丸中支持细胞通过产生血睾屏障、分泌因子以及吞噬细胞等功能来参与和保障精子的形成过程,随着支持细胞的成熟,相邻的支持细胞可通过建立由紧密连接、粘附连接和缝隙连接为主的血睾屏障形成免疫屏障,将机体的免疫系统和精子抗原分隔开,避免发生自身免疫性疾病同时保证精子发生所需的微环境。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,本实验体外培养高纯度支持细胞可以更好地为雄性弱精、不育症、激素异常等生殖障碍的发病机理相关研究服务。

关键词：

来源： cnki会议评论

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马卵巢石蜡切片制作体系的优化

黑龙江动物繁殖 2021年第6期29卷 4-9页

作者：陶力神英超阿鲁斯伊敏娜才文道力玛王希生田书岳芒来格日乐其木格内蒙古农业大学动物科学学院/内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室/农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站/内蒙古农业大学马属动物研究中心呼和浩特010018

为了建立和优化马卵巢石蜡切片制作体系,为完善马属动物繁殖理论知识奠定基础,试验以2~3岁蒙古马为研究对象,选择6匹健康母马卵巢组织,对比了不同固定方法、组织脱水方法、浸蜡方法及苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,H.E.)染色体系... 详细信息

为了建立和优化马卵巢石蜡切片制作体系,为完善马属动物繁殖理论知识奠定基础,试验以2~3岁蒙古马为研究对象,选择6匹健康母马卵巢组织,对比了不同固定方法、组织脱水方法、浸蜡方法及苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,H.E.)染色体系对石蜡切片制作效果的影响。结果表明:大于0.5 cm卵巢组织片段、经过3种固定液均达不到有效支持后期石蜡切片制作的条件;马卵巢石蜡切片制作需组织片段小于0.5 cm并采用Bouin固定液进行75%酒精浸泡24 h→85%酒精浸泡1 h→95%浸泡酒精2 h→100%酒精2 h脱水;二甲苯透明剂中放置10 min×2次;纯蜡与二甲苯按1∶1比例混合并浸蜡40 min→纯蜡Ⅰ40 min→纯蜡Ⅱ0.05 Mpa真空浸蜡40 min条件,以此为制作马卵巢组织石蜡切片的最佳体系。

关键词：马卵巢切片制作石蜡切片 H.E.染色