马脐静脉内皮细胞分离培养及其功能验证

作     者：赵比力格 温鑫 伊敏娜 才文道力玛 神英超 斯琴 照伦其其格 任宏 芒来 格日乐其木格 ZHAO Bilig;WEN Xin;YI Minna;Tseweendolmaa;SHEN Yingchao;SI Qin;Zhaolunqiqig;REN Hong;MANG Lai;Gerelchimeg

作者机构：内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物科学研究与技术创新重点实验室呼和浩特010020 

出 版 物：《中国畜牧兽医》 (China Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年第51卷第7期

页      面：2953-2962页

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

基　　金：内蒙古自治区自然科学基金(2023SHZR0557) 内蒙古农业大学优秀博士引进人才科研启动项目(NDYB2022-42) 

主　　题：马 脐静脉内皮细胞 Ⅰ型胶原酶消化法 培养鉴定 TNF-α 血管新生 

摘      要：【目的】建立一种简便且高效的体外马脐静脉内皮细胞(equine umbilical vein endothelial cells,eUVECs)分离和培养方法,并提供一个可靠的细胞模型,用于研究马的血管生成功能。【方法】在无菌条件下,从马脐带中分离静脉,并用PBS液彻底冲洗。使用0.2%Ⅰ型胶原酶对脐静脉进行消化25~30 min后,收集分离的eUVECs进行培养。每12 h使用倒置显微镜观察eUVECs的生长状况。使用CCK-8法测定第1代(P1)和P3代eUVECs在7 d内的D450 nm值,并绘制生长曲线。通过免疫荧光染色方法鉴定内皮细胞标记物CD31和CD34的表达情况。使用间充质干细胞成脂和成骨分化诱导试剂诱导eUVECs,以验证其是否具有分化特性。确定内皮细胞后,添加梯度上升浓度(5、10、15、20、25 ng/mL)的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激eUVECs,使用CCK-8法检测细胞活性,观察细胞形态变化。使用Matrigel法培养eUVECs,用ImageJ软件分析数据,并统计新生血管的4个指标:成管交叉点、成管长度、成管数和成管面积。寻找体外血管生成能力的最佳TNF-α刺激浓度。【结果】使用0.2%Ⅰ型胶原酶消化法分离的eUVECs 4~5 d内的汇合度达到90%。在倒置显微镜下观察,这些细胞生长良好并呈铺路石状排列。通过免疫荧光染色确认了CD31和CD34在eUVECs中的阳性表达;并且eUVECs表现出薄弱的成脂和成骨分化能力。在Matrigel法培养条件下,20 ng/mL TNF-α处理组的成管交叉点数、成管长度、成管数和成管面积等血管形成能力指标最高,且极显著高于对照组(P0.01)。然而,在常规培养条件下,随着TNF-α浓度增加到15 ng/mL,eUVECs的增殖受到显著抑制甚至开始导致细胞的凋亡。【结论】Ⅰ型胶原酶脐带注满消化法能够成功分离培养出原代eUVECs,20 ng/mL TNF-α显著增强eUVECs体外血管生成能力,eUVECs可以作为体外研究血管生成的细胞模型。