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两种细胞因子诱导人骨髓多能成体祖细胞向肝样细胞分化的作用

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中华肝脏病杂志 2005年第11期13卷 862-864页

作者：高毅唐力军慕宁南方医科大学珠江医院普外科广州510282

本实验用免疫磁性分离(MACS)方法分选骨髓间充质干细胞(MSCs)亚群MAPCs[1],用成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)及肝细胞生长因子(HGF)诱导其向肝细胞方向分化,并采用不同方法鉴定了细胞分化能力.

关键词：肝细胞生长因子成纤维细胞生长因子细胞分化免疫磁珠分离法骨髓间充质干细胞多能成体祖细胞细胞因子诱导人骨髓免疫磁性分离分化能力

ZHJ-MAPCs的细胞学初步分析鉴定及共培养诱导向肝样细胞分化研究

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ZHJ-MAPCs的细胞学初步分析鉴定及共培养诱导向肝样细胞分化研究

作者：慕宁第一军医大学

学位级别：硕士

治疗终末期肝病最有效的方法之一就是原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),然而,由于供体的缺乏、免疫排斥和高额费用等问题,OLT的广泛应用受到了限制。肝细胞移植(hepatocytes transplantation HCT)经过近30年的发展,正... 详细信息

治疗终末期肝病最有效的方法之一就是原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),然而,由于供体的缺乏、免疫排斥和高额费用等问题,OLT的广泛应用受到了限制。肝细胞移植(hepatocytes transplantation HCT)经过近30年的发展,正由动物实验向临床过渡,初步结果显示,肝细胞移植在急慢性肝衰竭和遗传代谢性肝病方面具有很好的应用前景,但同样面临肝细胞来源有限,排斥反应等问题的困扰。杂交型生物人工肝(Hybrid bioartificial liver,HBAL)治疗可以使终末期肝病病人桥接(bridge)肝移植,而且由于肝细胞具有强大的再生能力,临时应用生物人工肝也可以暂时代偿肝功能,促进肝细胞再生,部分患者肝功能完全恢复正常。但作为HBAL核心生物材料的肝细胞来源问题未得到根本解决,使HBAL的临床应用远未达到理论上的预期效果。研究证明人骨髓来源的多能成体祖细胞(Multipotent adult progenitor cells from bone marrow,MAPCs)具有向肝样细胞分化的潜能,由于其具有易于增殖、调控、供源丰富、容易获取、有自体供源避免免疫排斥等优点,有望成为理想的组织工程细胞来源。本课题组前期实验通过密度梯度离心—贴壁培养筛选—免疫磁性双阴性分选(magnetic activated cell sorting,MACS)三个步骤高效率地纯化分选出骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)亚群MAPCs(CD45,GlyA),并将之命名为ZHJ-MAPCs(Zhujiang-MAPCs)。通过改良细胞培养基等方法,我们建立了ZHJ-MAPCs的传代培养技术(结果尚未发表)。

关键词： ZHJ-MAPCs 细胞传代流式细胞仪细胞核型分析细胞系细胞株间接共培养直接共培养激光共聚焦显微镜细胞分化肝样细胞

人骨髓间充质干细胞亚群ZHJ-MAPCs特征表型及细胞遗传学分析

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中国临床康复 2006年第37期10卷 4-6,i0001页

作者：蒋泽生高毅慕宁南方医科大学珠江医院普外科广东省广州市510282

目的:对经过CD45,血型糖蛋白-A免疫微磁珠体外负分选纯化并传代培养的ZHJ-MAPCs进行体外部分细胞学鉴定,了解其特异性标志物表达及增殖、传代过程中的遗传学稳定性。方法:实验于2004-01/12在珠江医院中心试验室完成。①原代冻存的ZHJ-MA... 详细信息

目的:对经过CD45,血型糖蛋白-A免疫微磁珠体外负分选纯化并传代培养的ZHJ-MAPCs进行体外部分细胞学鉴定,了解其特异性标志物表达及增殖、传代过程中的遗传学稳定性。方法:实验于2004-01/12在珠江医院中心试验室完成。①原代冻存的ZHJ-MAPCs经复苏培养、传代。②利用流式细胞仪对其进行CD29,CD44,CD34和HLA-DR流式细胞分析,以对照管作为空白定标,计算10000个细胞,记录标本的阳性细胞百分率。③分别在传代至第6代和第13代时进行细胞核型分析了解细胞核型变化。④细胞计数及细胞活力检测方法:细胞数/mL=四个大方格总数/4×104×稀释倍数。细胞存活率=5g/L锥虫蓝染色阴性细胞/100个细胞/高倍镜×100。结果:①流式细胞仪检测结果:流式细胞仪检测ZHJ-MAPCs中CD29阳性表达细胞比率为99.2%,CD44阳性细胞比率为98.3%,CD34阳性细胞比率为1.2%,HLA-DR阳性细胞比率为5.3%。②细胞核型分析结果:ZHJ-MAPCs在增殖传代过程中表现出非正常二倍体特征,染色体干系数目在第6,13代均为55～58条,占80%,染色体数介于超二倍体和亚三倍体之间,镜下见细胞均发生染色体变异,且变异形态多样。结论:①ZHJ-MAPCs具有骨髓间充质干细胞的特征及较高的纯度。②ZHJ-MAPCs在增殖传代过程中表现出非正常二倍体特征,染色体数介于超二倍体和亚三倍体之间,染色体变异形态多样。

关键词：骨髓细胞间质干细胞表型

落新妇甙对肝缺血再灌注损伤细胞因子信号转导抑制分子1表达的影响

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中华实验外科杂志 2014年第4期31卷 765-767页

作者：慕宁江艺杨芳解放军南京军区福州总院肝胆外科福州350025

目的观察落新妇甙对肝脏缺血再灌注损伤中对炎症信号通路的影响，探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制。方法C57BL/6小鼠随机分为4组：假手术组（Sham）、模型组（I/R）、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组和落新妇甙大剂量（40mg/kg）... 详细信息

目的观察落新妇甙对肝脏缺血再灌注损伤中对炎症信号通路的影响，探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制。方法C57BL/6小鼠随机分为4组：假手术组（Sham）、模型组（I/R）、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组和落新妇甙大剂量（40mg/kg）干预组。缺血前24h和1h干预组小鼠腹腔注射分别给予10mg/kg或40mg/kg落新妇甙，建立肝左、中叶70％部分肝缺血再灌注模型，模型组和假手术组给予同体积的生理盐水。小鼠肝脏左叶缺血90rain、再灌注6h后各实验组采集血液和肝脏组织样本。Western blot检测肝组织中细胞因子信号转导抑制分子1（SOCS-1）、白细胞介素（IL）-10蛋白含量，半定量逆转录一聚合酶链反应（SqRT-PCR）检测上述分子mRNA表达。结果落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中SOCS-1、IL-10蛋白表达与I/R模型对照组比较均逐渐升高，与SqRT-PCR结果相符（P〈0．05）。结论落新妇甙干预能促进缺血再灌注损伤肝组织中IL-10蛋白及mRNA的高表达，从而起到抑制炎症的作用；落新妇甙干预能促进缺血再灌注损伤肝组织SOCS-1蛋白和mRNA的表达，显示其可能通过上调SOCS-1负调节通路，产生抑制炎症的作用。

关键词：落新妇甙肝缺血再灌注损伤白细胞介素-10 细胞因子信号转导抑制分子1

人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞体外直接共培养向肝样细胞分化的实验研究

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广东医学 2007年第2期28卷 202-204页

作者：蒋泽生高毅慕宁南方医科大学珠江医院普外科

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性。方法直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50%比例混合行直接共培养。5 d后用SABC-... 详细信息

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性。方法直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50%比例混合行直接共培养。5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况。并设阳性对照(单独培养的L02细胞)和阴性对照(单独培养未经诱导的ZHJ-MAPCs)。结果在共培养第5天检测ALB和CK18时出现较多胞浆内呈黄色荧光的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs,而在检测AFP时阳性细胞较少。结论ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行直接共培养能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化。

关键词：人骨髓来源多能成体祖细胞肝细胞直接共培养

人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞分化的实验研究

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中华肝脏病杂志 2007年第3期15卷 174-178页

作者：慕宁王明元林雨冬高毅解放军福州总医院95临床部普外科福建省莆田351100 南方医科大学珠江医院普外科

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法（1）取健康成人志愿者适量骨髓采用CD45、糖化蛋白A（GlyA）... 详细信息

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法（1）取健康成人志愿者适量骨髓采用CD45、糖化蛋白A（GlyA）免疫微磁珠负分选，纯化培养CD45^-、GlyA^-hMAPCs。（2）间接共培养：将分别接种于盖玻片上的传代hMAPCs和人肝细胞系L02（密度均为1×10^5／ml）按照各50％比例共置于直径10cm培养皿中，培养液共通，实现间接共培养。分别于第1、3、5、7天免疫细胞化学鉴定hMAPCs的Alb、AFP、细胞角蛋白18（CK18）、细胞角蛋白19（CK19）等肝细胞特征性表型表达变化情况，并设阳性对照（单独培养的L02细胞）和阴性对照（单独培养未经诱导的hMAPCs），计数阳性细胞比率。（3）直接共培养：将CFSE荧光（绿色）标记的hMAPCs与L02（密度均为1×10^4／ml）按照各50％比例混合后接种于激光共聚焦显微镜检查专用培养皿内，实现直接共培养。5d后用SABC-Cy3免疫荧光（红色）双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察hMAPCs表达Alb、AFP、CK18的情况。同样设阳性对照（单独培养的CFSE标记L02细胞）和阴性对照（单独培养的CFSE标记MAPCs）。镜下表达黄色荧光的细胞即是向肝细胞分化的MAPCs，为阳性细胞；单纯表达绿色荧光的细胞为未分化的MAPCs；单纯表达红色荧光的细胞为L02细胞。结果（1）间接共培养结果：AFP作为不成熟肝细胞的表型标志，在间接共培养第l天表现为强阳性表达，随后逐渐减弱，至第7天，AFP的阳性表达已经很少。而Alb在第l天有可疑阳性表达，第3天，Alb即出现较强的阳性表达，第5天，Alb的阳性表达就达到高峰，第7天，密集生长的细胞仍广泛的阳性表达Alb。第l、3天检测CK18均为阴性，至第5天CK18开始出现阳性表达，第7天CK18阳性表达较前增强。CK19在各时间点均为阴性着色。阳性对照细胞Alb及CK18有较强的阳性表达，AFP弱阳性表达，CK19阴性表达。阴性对照细胞均为阴性表达。（2）直接共培养结果：Alb和CK18检测时，较多细胞质内出现黄色荧光表达，而AFP阳性荧光表达则仅出现在极个别细胞质内，该结果与阳性对照细胞荧光表达类似，而阴性对照细胞未见有阳性荧光表达。结论（1）与人肝细胞系L02间接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化。（2）与人肝细胞系L02直接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化，且时间有提前趋势。

关键词：肝细胞共同培养细胞分化显微镜检查共焦人骨髓来源多能成体祖细胞

落新妇甙对缺血再灌注损伤肝脏HO-1表达的影响

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世界华人消化杂志 2013年第35期21卷 4019-4023页

作者：慕宁江艺吕立志中国人民解放军南京军区福州总院肝胆外科福建省福州市350025

目的:通过观察落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤中血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)表达的影响,探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制.方法:C57BL/6小鼠随机分为4组(n=8):假手术组(Sham)、模型组(I/R)、落新妇甙小剂量(10 mg/kg)干... 详细信息

目的:通过观察落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤中血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)表达的影响,探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制.方法:C57BL/6小鼠随机分为4组(n=8):假手术组(Sham)、模型组(I/R)、落新妇甙小剂量(10 mg/kg)干预组和落新妇甙大剂量(40 mg/kg)干预组.缺血前24和1 h干预组小鼠腹腔注射分别给予10或40 mg/kg的落新妇甙,建立肝左、中叶70%部分肝缺血再灌注模型,模型组和假手术组给予同样体积的生理盐水.小鼠肝脏左叶缺血90 min、再灌注6 h后各实验组采集血液和肝脏组织样本.检测血清中丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)活性,Western blot检测肝组织中核因子B(nuclear factor B,NF-B)和HO-1蛋白含量,半定量RT-PCR检测上述分子mRNA表达情况.结果:落新妇甙小、大剂量干预后血清ALT含量较I/R对照组均明显下降(假手术组:142U/L±25 U/L;模型组:3521 U/L±270 U/L;落新妇甙小剂量干预组:1766 U/L±179 U/L;落新妇甙大剂量干预组:1067 U/L±101 U/L,P<0.01);落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中NF-B蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次降低;落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中HO-1蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次升高,亦与半定量RT-PCR结果相符(假手术组:0.53 U/L±0.07 U/L;模型组:1.00 U/L±0.11 U/L;落新妇甙小剂量干预组:1.17 U/L±0.16 U/L;落新妇甙大剂量干预组:1.57 U/L±0.07 U/L小剂量干预组P<0.05;大剂量干预组P<0.01).结论:落新妇甙干预能降低缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)引起的血清A LT水平升高;落新妇甙干预能降低I R I肝组织中NF-B蛋白的高表达,促进IRI肝组织HO-1蛋白和mRNA的表达,显示其保护作用与促进HO-1的表达密切相关.

关键词：丙氨酸转氨酶核因子-B血红素加氧酶1 Western blot 半定量RT—PCR

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胰源性门静脉高压症7例诊治分析

中国普通外科杂志 2011年第3期20卷 298-300页

作者：赵德希张绍庚慕宁刘虎福建医科大学福总临床医学院肝胆外科福建福州350025

目的探讨胰源性门静脉高压症的临床诊断和治疗方法。方法回顾分析收治的7例胰源性门静脉高压症患者的临床资料。6例有慢性胰腺炎病史,其中4例合并假性囊肿,1例为胰体尾部癌。术前肝功能检查均正常。5例出现上消化道出血,胃镜检查发现胃... 详细信息

目的探讨胰源性门静脉高压症的临床诊断和治疗方法。方法回顾分析收治的7例胰源性门静脉高压症患者的临床资料。6例有慢性胰腺炎病史,其中4例合并假性囊肿,1例为胰体尾部癌。术前肝功能检查均正常。5例出现上消化道出血,胃镜检查发现胃底静脉曲张。结果 7例均行手术治疗,单纯脾切除2例,胰周坏死组织清除+脾切除+门奇静脉断流术1例,胰尾囊肿切除+脾切除术1例,假性囊肿内引流+脾切除术2例,胰体尾切除+脾切除术1例。术后随访胃底静脉曲张消失,均未再发生出血。结论胰源性门静脉高压症手术治疗效果令人满意,对有症状的患者,在治疗胰腺疾病的同时应附加脾切除术。

关键词：高压症,门静脉/继发性胰腺疾病胃底静脉曲张脾切除术

膨胀剂和后浇带对超长环形底板混凝土防裂的影响研究

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水力发电 2024年第6期50卷 61-66页

作者：任锦龙荣慕宁王振红邢国荣汪娟张步张凯恒北京建工集团有限责任公司北京100055 中国水利水电科学研究院结构材料所北京100038

世界上亮度最高的第四代高能同步辐射光源的超长环形底板周长约1494 m、厚1 m,如何保证底板混凝土施工质量防止裂缝产生是工程的难点。建立有限元三维数值分析模型,按照实际施工过程仿真底板混凝土的跳仓浇筑过程,模拟分析底板混凝土温... 详细信息

世界上亮度最高的第四代高能同步辐射光源的超长环形底板周长约1494 m、厚1 m,如何保证底板混凝土施工质量防止裂缝产生是工程的难点。建立有限元三维数值分析模型,按照实际施工过程仿真底板混凝土的跳仓浇筑过程,模拟分析底板混凝土温度及温度应力变化情况,同时将计算温度结果与实测温度结果进行对比,验证热学参数的合理性和准确性。在反演分析基础上,研究膨胀剂和后浇带的温控防裂效果。研究结果表明:早膨胀型自变(Ⅰ型)对混凝土早龄期应力的影响是有利的,但晚膨胀型自变(Ⅲ型)的延迟膨胀性补偿由于混凝土收缩和温降引起的应力,有利于减小底板冬季最大拉应力;设置后浇带能减小底板混凝土分缝分块长度,削减混凝土最大拉应力,削减幅度为6.65%。

关键词：混凝土环形底板膨胀剂后浇带反演分析温度应力