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鼠层粘蛋白α5链E_3、LG_4、LG_5片段的克隆及表达

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中国兽医学报 2004年第5期24卷 467-469页

作者：孙兆增张玉静展德文张艳宇连继勤解放军军需大学军事兽医系吉林长春130062

从鼠的肝脏组织中提取总 RNA,采用 RT- PCR获得了鼠层粘蛋白 ( laminin)α5链的 E3 ( L G4 - 5)、L G4 和 L G5等 3个基因片段 ,与 NCBI数据库参考序列相比 ,同源性在 99%以上。将 E3 ( L G4 ,5)、L G4 和 L G5定向克隆到原核高效表达载... 详细信息

从鼠的肝脏组织中提取总 RNA,采用 RT- PCR获得了鼠层粘蛋白 ( laminin)α5链的 E3 ( L G4 - 5)、L G4 和 L G5等 3个基因片段 ,与 NCBI数据库参考序列相比 ,同源性在 99%以上。将 E3 ( L G4 ,5)、L G4 和 L G5定向克隆到原核高效表达载体 Pet- 2 8a中 ,构建 Pet- 2 8a- E3 、Pet- 2 8a- L G4 、Pet- 2 8a- L G5等 3个原核表达质粒。将表达质粒转化表达受体菌 BL2 1中 ,IPTG诱导表达。收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western- blotting分析 ,结果显示 ,这 3段基因在原核细胞中成功表达 ,薄层扫描显示表达蛋白占细胞总蛋白的 2 0 %以上。大量提取包涵体 ,纯化后免疫家兔 ,8周后得多克隆抗体 ,间接 EL ISA在抗体稀释到 1∶ 1 2 80

关键词：鼠层粘蛋白克隆表达细胞基质信号分子

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炭疽芽胞杆菌疫苗研究进展

微生物学报 2005年第1期45卷 149-152页

作者：展德文王芃王令春张兆山军事医学科学院生物工程研究所北京100071

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘... 详细信息

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘膜免疫能够诱导机体分泌IgA抗体 ;抗多聚谷氨酸 (γ D PGA)抗体可以同炭疽杆菌的繁殖体作用 ,从而杀死繁殖体 ;寻找到新的免疫原。DNA疫苗、活载体疫苗的出现为新一代安全、免疫程序简单。

关键词：炭疽芽胞杆菌保护性抗原疫苗

幽门螺杆菌hp0596基因缺失突变体的构建

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世界华人消化杂志 2010年第24期18卷 2579-2583页

作者：韩秀萍展德文王芃李丛胜袁盛凌陶好霞张丽邱炎李家奎刘纯杰中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所北京市100071 华中农业大学动物医学院湖北省武汉市430070

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***)hp0596基因缺失突变体,为进行hp0596基因功能研究奠定基础.方法:利用PCR技术,从*** 26695基因组分别扩增得到hp0596基因的上游同源臂和下游同源臂,与两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段... 详细信息

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***)hp0596基因缺失突变体,为进行hp0596基因功能研究奠定基础.方法:利用PCR技术,从*** 26695基因组分别扩增得到hp0596基因的上游同源臂和下游同源臂,与两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化入*** 26695;在抗生素选择压力下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过氯霉素抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌.结果:构建的突变载体经限制性内切酶酶切分析显示,产生的条带与预计结果完全一致.PCR方法扩增突变株0596,cmr基因显示,0596基因已经被完全敲除,经DNA测序,RNA水平,蛋白质水平证实筛选得到了0596基因缺失的***26695△0596突变株.连续培养7代后,***26695△0596突变株具有良好的稳定性.结论:获得了***26695△0596基因缺失突变体.

关键词：幽门螺杆菌 hp0596基因突变体

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幽门螺杆菌HspA亚基的表达与纯化

世界华人消化杂志 2005年第5期13卷 626-630页

作者：刘秀丽张兆山陶好霞展德文刘纯杰北京生物工程研究所北京市100071

目的:利用原核表达载体高效表达幽门螺杆菌热休克蛋白A(HspA),并进行纯化. 方法:PCR扩增hspA基因,将其克隆至原核表达载体pET22b,pQE-60,pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS—PAGE分析表达.利用镍离子亲和层析对表达产物进行纯... 详细信息

目的:利用原核表达载体高效表达幽门螺杆菌热休克蛋白A(HspA),并进行纯化. 方法:PCR扩增hspA基因,将其克隆至原核表达载体pET22b,pQE-60,pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS—PAGE分析表达.利用镍离子亲和层析对表达产物进行纯化.免疫印迹检测蛋白的抗原性. 结果:PCR扩增得到hspA基因,在载体pQE-60中以HspA和HspA-His6两种形式得到表达,表达量高达菌体总蛋白的40%以上.经镍离子亲和层析后,纯化率分别为88.63%和86.32%,但HspA—His6在纯化过程中发生降解.免疫印迹实验表明,HspA和HspA-His6都有很好的抗原性. 结论:实现了HspA蛋白的高效表达和纯化,为幽门螺杆菌HspA亚单位疫苗的免疫实验奠定基础.

关键词：幽门螺杆菌表达与纯化 A亚基原核表达载体 hspA基因 HspA PCR扩增免疫印迹检测免疫印迹实验高效表达亲和层析热休克蛋白亚单位疫苗大肠杆菌表达产物 PAGE 纯化过程免疫实验抗原性镍离子 SDS 总蛋白表达量

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

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生物化学与生物物理进展 2009年第7期36卷 934-940页

作者：王艳春姜娜展德文邱炎袁盛凌陶好霞王令春张兆山刘纯杰军事医学科学院生物工程研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室北京100071

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以***基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化***422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过... 详细信息

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以***基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化***422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在***中的应用方法,并成功敲除eag基因.

关键词：炭疽芽胞杆菌 Cre-LoxP系统 eag基因同源重组基因敲除

蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达

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生物工程学报 2009年第4期25卷 526-532页

作者：袁盛凌王芃陶好霞展德文王艳春王令春刘纯杰张兆山中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所北京100071

蛇毒类凝血酶是临床上防治血栓栓塞性疾病的有效药物。参照朝鲜蝮蛇(Agkistrodon caliginosus,Korean Viper)类凝血酶calobin基因序列(GenBank AccessionNo.U32937.1),将人工合成的calobin基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,于毕赤酵母中表达,得到了分子量约为32kD的重组calobin蛋白,经甲醇诱导培养,表达产物可获得3.5g/L的高表达量。重组蛋白经过阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow和分子筛Sephacryl-S-100凝胶过滤层析等纯化步骤进行了初步纯化。纯化后的重组calobin可以在纤维蛋白原平板上形成水解圈,经SDS-PAGE实验显示,重组蛋白能水解纤维蛋白原的Aα链,产生一条约40kD左右的降解带。在实验中未能发现重组calobin对纤维蛋白原的凝固作用。

关键词：蛇毒类凝血酶毕赤酵母 calobin 纤维蛋白原

利用λ-Red重组系统和平衡致死系统改造抗药性致腹泻工程疫苗

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微生物学通报 2006年第2期33卷 10-15页

作者：袁盛凌王芃刘向昕王艳春展德文张兆山军事医学科学院生物工程研究所北京100071

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B+基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质... 详细信息

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B+基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质粒转移到缺失asd基因的大肠杆菌X6097中。但由于质粒pMM085是一个23kD的大质粒,传统的基因工程操作不易进行,利用λ-Red重组系统,将表达Red重组蛋白的质粒pKD46转化含pMM085的大肠杆菌X6097,并用两端各带有39ntcat基因同源区、含全长asd基因的PCR产物电击转化此感受态细胞,在λ-Red重组系统的帮助下,成功实现了asd基因对cat基因的置换。

关键词： λ-Red重组系统抗药性基因平衡致死系统

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树突状细胞和癌症的免疫学治疗

生物技术通讯 2004年第6期15卷 604-606页

作者：展德文刘向昕张兆山军事医学科学院生物工程研究所北京100071

树突状细胞(dendritccells,DC)是一种抗原提呈细胞,能特异地引发和调控机体免疫。它具有抗原呈现功能而不损害免疫系统,不仅能够激活CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞,还能活化B细胞和自然杀伤细胞。已有的研究让人们看到了癌症疫苗的... 详细信息

树突状细胞(dendritccells,DC)是一种抗原提呈细胞,能特异地引发和调控机体免疫。它具有抗原呈现功能而不损害免疫系统,不仅能够激活CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞,还能活化B细胞和自然杀伤细胞。已有的研究让人们看到了癌症疫苗的希望,但还处于早期阶段,有许多尚未确定的因素。因此有关DC疫苗用于对肿瘤的保护性和治疗性免疫还有待于进一步的研究。

关键词：树突状细胞免疫学治疗肿瘤癌症疫苗 CD8^+细胞 DC疫苗辅助T细胞早期阶段调控毒性

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细菌表面展示技术的应用研究进展

微生物学免疫学进展 2005年第2期33卷 70-74页

作者：刘向昕展德文张兆山军事医学科学院生物工程研究所北京100071

细菌表面展示系统是微生物表面展示系统的一个重要分支。由于呈现载体灵活多样,可根据不同的需要呈现蛋白或多肽等特点,细菌表面展示技术近年来得到了迅猛发展,在重组细菌疫苗、抗原表位分析、全细胞催化剂、全细胞吸附剂、多肽库筛选... 详细信息

细菌表面展示系统是微生物表面展示系统的一个重要分支。由于呈现载体灵活多样,可根据不同的需要呈现蛋白或多肽等特点,细菌表面展示技术近年来得到了迅猛发展,在重组细菌疫苗、抗原表位分析、全细胞催化剂、全细胞吸附剂、多肽库筛选等多个领域得到广泛应用。本文就细菌表面展示技术的应用研究作一综述。

关键词：细菌表面展示革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌