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龙胆苦苷对肝细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达影响

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龙胆苦苷对肝细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达影响

作者：封欣婵第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的胆汁淤积是由于多种原因所导致的胆汁流动异常而引起的常见临床综合症，直接导致肝细胞损伤、肝功能衰竭。其共同的分子发生机制为：肝细胞表面胆汁酸转运蛋的表达异常。在生理状态下，机体内胆汁酸处于稳定状态，而分... 详细信息

研究背景及目的胆汁淤积是由于多种原因所导致的胆汁流动异常而引起的常见临床综合症，直接导致肝细胞损伤、肝功能衰竭。其共同的分子发生机制为：肝细胞表面胆汁酸转运蛋的表达异常。在生理状态下，机体内胆汁酸处于稳定状态，而分布于“极性化”肝细胞膜上的胆酸转运蛋白系统的精密调节是维持这种稳态的关键，它们主要包括：肝细胞顶膜的MRP2(multidrug resistance-associated protein2)、BSEP (Bile salt export pump)等;基底侧膜的MRP3(multidrug resistance-associated protein3)、MRP4(multidrugresistance-associated protein4)等。先天或后天获得性致病因素常导致肝细胞膜胆酸转运蛋白异常表达，致使胆酸排泌障碍，胆汁酸稳态失衡，发生、发展为胆汁淤积症。正常情况下，MRP3低表达或不表达，而在胆汁淤积情况下则高表达。因此，胆汁淤积情况下MRP3高表达被认为是肝脏自我保护性反应机制之一。MRP4与MRP3相似，它能够促使更多的胆汁酸排入血液。我们及国外同行前期在动物实验和人体标本研究发现，MRP3分子在胆汁淤积中对保护肝细胞起到了关键作用。在胆汁淤积的大鼠模型、梗阻性黄疸及Dubin综合征患者的肝脏组织标本中，均发现了MRP3蛋白的高表达。而MRP4基因敲除的大鼠胆汁淤积的模型中发现其肝损伤的程度明显严重于野生型大鼠胆汁淤积模型。目前，胆汁淤积的临床治疗缺乏有效的药物，UDCA是唯一应用于临床且公认有一定疗效的药物，但其治疗效果有限、个体差异大、副作用大;利福平、苯巴比妥等药物的治疗效果不理想。川西獐芽菜是治疗“肝胆湿热症”功效独特的名贵药材。我们从中分离出了24种对治疗胆汁淤积可能有效单体，其中发现龙胆苦苷不仅可以刺激MRP3分子的高表达，同时还可能上调促进胆酸排泌的MRP2、MRP4、BSEP基因的表达。这在胆汁淤积状态下将更有利于胆汁酸、胆红素等有毒物质及时排泌出肝细胞，起到保护肝脏的作用，其治疗胆汁淤积的效果理论上也应该更优越于UDCA。因此，川西獐牙菜单体“龙胆苦苷”为解决“胆汁淤积的临床治疗缺乏特效药物”这一难题提供了新的重要线索。研究方法 1.龙胆苦苷50μM体外刺激HepG2细胞，以UDCA50μM为阳性对照、DMSO50μM为阴性对照。Real Time PCR检测药物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、MRP4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR基因mRNA表达的影响;Western Blot检测药物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、MRP4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR蛋白表达的影响。 2.建立胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型，随机分为实验组：龙胆苦苷100mg/kg、阳性对照组：UDCA90mg/kg、阴性对照组：生理盐水。处理7d后，HE染色观察肝脏损伤情况;Real Time PCR检测大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp3、Mrp4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR基因mRNA水平的变化;Western Blot检测大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp3、Mrp4及其相关核受体VDR、PXR、CAR、RXR及RAR蛋白水平的变化。结果 1.细胞水平：Real Time PCR结果表明：龙胆苦苷不仅能够明显上调HepG2细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4基因的表达也能够调节核受体CAR、PXR基因mRNA的表达;Western Blot结果表明：在蛋白水平，龙胆苦苷即能刺激HepG2细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达，又能够促进其相关核受体CAR及PXR的表达，这与mRNA水平变化一致，且龙胆苦苷的作用明显强于UDCA。 2.动物水平： Real Time PCR及Western Blot结果表明龙胆苦苷不仅在mRNA水平也能够在蛋白水平调节肝细胞膜转运蛋白Mrp3、Mrp4的表达且核受体CAR及PXR的表达也增高。结论本项研究的体内外实验均表明：龙胆苦苷能够刺激肝细胞表面膜转运蛋白MRP3、MRP4及其相关核受体CAR及PXR在mRNA和蛋白水平的表达，且其作用明显强于UDCA。因此，我们推测：龙胆苦苷通过核受体CAR及PXR调节肝细胞膜转运蛋白MRP3、MRP4的表达。

关键词：多药耐药相关蛋白3 多药耐药相关蛋白4 核受体龙胆苦苷熊脱氧胆酸

Radixin定点突变过表达对HepG2细胞膜转运蛋白Bsep的影响

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第三军医大学学报 2014年第10期36卷 1002-1007页

作者：封欣婵柴进程英陈文生第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的构建pcDNA3.1-RDX定点突变真核过表达质粒,研究其在胆汁淤积时对HepG2细胞膜转运蛋白胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)定位表达的影响。方法从含有RDX野生型质粒中,利用PCR方法钓取RDX野生型基因片段并以野生型为基础进行定... 详细信息

目的构建pcDNA3.1-RDX定点突变真核过表达质粒,研究其在胆汁淤积时对HepG2细胞膜转运蛋白胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)定位表达的影响。方法从含有RDX野生型质粒中,利用PCR方法钓取RDX野生型基因片段并以野生型为基础进行定点突变,PCR扩增后转入pcDNA3.1载体,其产物转化DH-5α感受态细胞。对长出的单克隆进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确即为构建成功的目的质粒。将目的质粒转染HepG2细胞,经G418筛选构建稳转细胞株。提取各株细胞的总蛋白,检测磷酸化RDX是否影响HepG2细胞膜上转运蛋白Bsep的表达。结果 PCR和测序结果均证实pcDNA3.1-RDX WT、pcDNA3.1-RDX T564D、pcDNA3.1-RDX T564A过表达载体构建成功。蛋白免疫印迹表明,与转染pcDNA-3.1-RDX-WT的HepG2相比,转染pcDNA-3.1-T564D的HepG2的Bsep膜蛋白表达量显著增加(P0.05)。结论成功构建了pcDNA3.1-RDX WT、pcDNA3.1-RDX T564D、pcDNA3.1-RDX T564A过表达载体,并证实RDX的磷酸化能增强HepG2细胞膜上Bsep的表达。

关键词： RDX定点突变载体构建 pcDNA3 1载体胆盐输出泵

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加强临床医学研究生科研思维自我培养的思考

人民军医 2016年第5期59卷 531-532页

作者：柴进封欣婵陈文生第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

科研思维是最基本、最重要的科研能力之一,科研思维的培养已成为研究生教学实践中的重要课题之一。本文探讨了临床医学研究生加强科研思维的自我培养,提高科研创新能力的方法。

关键词：临床医学研究生科研思维自我培养

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关于基层医院进修医师消化内镜教学的实践

局解手术学杂志 2015年第6期24卷 682-683页

作者：柴进陈文生封欣婵向国春第三军医大学西南医院消化内科重庆400038 第三军医大学西南医院临床教学管理中心重庆400038

消化内镜技术为诊断胃肠道疾病非常重要的技术。近年来，随着技术的发展，内镜技术已不再局限于单纯的诊断，而被越来越广泛地应用于内镜下组织粘合剂、套扎及硬化治疗食管胃底静脉曲张破裂出血等。我院内镜中心为西南地区最大的消化内... 详细信息

消化内镜技术为诊断胃肠道疾病非常重要的技术。近年来，随着技术的发展，内镜技术已不再局限于单纯的诊断，而被越来越广泛地应用于内镜下组织粘合剂、套扎及硬化治疗食管胃底静脉曲张破裂出血等。我院内镜中心为西南地区最大的消化内镜诊疗培训中心，每年接收近千名基层医师及本科室研究生、实习生学习内镜诊疗技术，在临床带教过程中我们始终贯穿规范化教学，经过3—6个月的培训，取得了令人满意的效果。现报告如下。

关键词：消化系统教学基层医院进修医师内镜

川西獐牙菜单体齐墩果酸上调阻塞性胆汁淤积大鼠肝脏核受体Lrh-1和胆酸转运蛋白Mrp3的表达

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第三军医大学学报 2015年第8期37卷 778-781页

作者：张樑君封欣婵李绍雪高宇程英陈文生柴进第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的建立胆道结扎的大鼠模型,观察川西獐牙菜活性单体齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对胆道结扎所致的肝外胆汁淤积的保护作用,及其对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistanceassociated protein 3,Mrp3)、核受体Lrh-1的调控作用。方法采... 详细信息

目的建立胆道结扎的大鼠模型,观察川西獐牙菜活性单体齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对胆道结扎所致的肝外胆汁淤积的保护作用,及其对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistanceassociated protein 3,Mrp3)、核受体Lrh-1的调控作用。方法采用随机数字表法将15只SD大鼠分为3组:假结扎组(Sham组)、胆道结扎组(BDL组)、齐墩果酸组(BDL+OA组),每组5只。分别用生理盐水、齐墩果酸处理7 d后,收集组织标本,HE染色检测肝脏损伤程度,Western blot及RT-PCR检测Mrp3和Lrh-1在蛋白及mRNA水平的变化。结果 HE染色结果显示BDL+OA组肝脏损伤程度较胆道结扎组明显减轻;Western blot结果表明BDL+OA组Mrp3表达较Sham组增加2.4倍,Lrh-1表达增加1.8倍;RT-PCR结果显示BDL+OA组Mrp3表达较Sham组增加3.2倍,Lrh-1表达升高2.2倍。结论川西獐牙菜单体齐墩果酸对胆道结扎所致大鼠胆汁淤积性肝损伤具有保护作用,而这种保护作用可能与Lrh-1、Mrp3有关。

关键词：胆汁淤积齐墩果酸多药耐药相关蛋白3 转录因子

Ezrin上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP2的表达

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第三军医大学学报 2015年第19期37卷 1951-1954页

作者：柴进封欣婵张樑君程英陈兰芳胡珍陈文生第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的建立Ezrin基因表达缺失的Hep G2细胞株,并研究其在胆汁淤积时对Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)的影响。方法不同位点干扰的Ezrin-shRNA质粒转染Hep G2细胞,筛选Ezrin... 详细信息

目的建立Ezrin基因表达缺失的Hep G2细胞株,并研究其在胆汁淤积时对Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)的影响。方法不同位点干扰的Ezrin-shRNA质粒转染Hep G2细胞,筛选Ezrin基因表达缺失的Hep G2细胞。分别提取细胞总蛋白和膜蛋白,检测Ezrin基因表达缺失是否影响Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白MRP2的表达。结果 RT-q PCR结果证实,Ezrin-shRNA#3质粒转染Hep G2细胞后成功抑制了Ezrin基因表达,抑制率为70%。蛋白免疫印迹表明,Ezrin基因表达缺失后,Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白MRP2表达增高,但与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白免疫共沉淀检测生物素化MRP2膜蛋白表明,Ezrin基因表达缺失后,无论是胞浆中还是细胞膜上,MRP2膜蛋白均表达增高(P<0.05)。结论 Ezrin基因表达缺失后能够上调Hep G2细胞中MRP2膜蛋白,使其表达增高。

关键词： Ezrin基因缺失胆汁淤积多药耐药相关蛋白2

川西獐牙菜醇提物对大鼠胆汁酸转运蛋白Mrp4、转录因子Nrf2表达的影响

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第三军医大学学报 2015年第10期37卷 957-961页

作者：杜晓煌柴进封欣婵张樑君程英陈文生方勇飞第三军医大学西南医院中西医结合科重庆400038 第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的观察川西獐牙菜醇提物对肝细胞胆汁酸转运蛋白Mrp4(multidrug resistanceassociated protein 4,Mrp4)、转录因子Nrf2的调控作用。方法将14只SD大鼠分为2组:正常对照组、川西獐牙菜醇提物组,每组7只。分别用生理盐水、川西獐牙菜醇... 详细信息

目的观察川西獐牙菜醇提物对肝细胞胆汁酸转运蛋白Mrp4(multidrug resistanceassociated protein 4,Mrp4)、转录因子Nrf2的调控作用。方法将14只SD大鼠分为2组:正常对照组、川西獐牙菜醇提物组,每组7只。分别用生理盐水、川西獐牙菜醇提物处理7 d后,收集组织标本,免疫组化检测Mrp3、Mrp4在肝脏的表达变化,Western blot及RT-PCR检测胆汁酸转运蛋白Mrp3、Mrp4和转录因子Nrf2、核受体Lrh-1在蛋白及mRNA水平的变化。结果在mRNA水平,RT-q PCR结果显示川西獐牙菜醇提物组肝脏胆汁酸转运蛋白Mrp4表达较正常对照组增加2.1倍,同时,Mrp3表达增加1.7,转录因子Nrf2表达增高1.8倍,核受体Lrh-1表达增高1.4倍;在蛋白水平,Western blot结果表明川西獐牙菜醇提物组肝脏胆汁酸转运蛋白Mrp4表达较正常对照组组增加2.5倍,同时,Mrp3表达增高3.0倍,转录因子Nrf2表达增高2.3倍,核受体Lrh-1表达增高1.3倍,而免疫荧光结果则进一步证实了RT-q PCR与Western blot的结果,显示川西獐牙菜醇提物组Mrp3、Mrp4的表达较正常对照组组明显增强。结论川西獐牙菜醇提物能够刺激肝细胞表面胆汁酸转运蛋白Mrp4表达增高,这种调控作用可能与Nrf2相关。

关键词：胆汁淤积川西獐牙菜醇提物多药耐药相关蛋白4 转录因子

利用GF-1 WFV影像和FY-3D MERSI火点产品提取过火区的方法

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遥感学报 2024年第2期28卷 375-384页

作者：单天婵郑伟陈洁国家卫星气象中心北京100081

利用遥感技术获取过火区信息对生态环境监测具有重要意义,其中高分辨率数据更适合提取小范围过火区。目前已有多种利用国外火点产品结合遥感影像提取过火区的研究。为了增强国产遥感数据火情监测能力,提高小范围过火区的提取效率和精度... 详细信息

利用遥感技术获取过火区信息对生态环境监测具有重要意义,其中高分辨率数据更适合提取小范围过火区。目前已有多种利用国外火点产品结合遥感影像提取过火区的研究。为了增强国产遥感数据火情监测能力,提高小范围过火区的提取效率和精度,基于过火前后2幅GF-1 WFV影像和多时相FY-3D MERSI火点产品开展过火区提取研究。2处研究区分别位于四川省凉山彝族自治州木里藏族自治县和西昌市。首先根据火点与过火区形成的关系,结合火点的时间、空间和光谱特征,筛选并扩充火点像元,确定过火区粗略范围;然后确定每种地表类型的分割阈值,分类过火像元和非过火像元;最后剔除周边小斑块,得到过火区提取结果。以人机交互方式获得的过火区参考真值作验证,并与神经网络分类法提取过火区的结果作对比。结果表明本文方法的过火区提取结果精度要明显高于神经网络分类法,Kappa系数达到0.82。该方法可以充分结合GF-1 WFV影像和FY-3D MERSI火点产品数据的优势,降低样本像元选择时间成本和不确定性,快速准确地提取小范围过火区。未来可考虑通过选择更高精度的火点产品,结合实地考察验证对该方法改进完善。

关键词：遥感过火区火点监测产品 FY-3D MERSI GF-1 WFV NDVI 阈值分割

书写的身体与流变的身体——阿尔托和德勒兹的“无器官的身体”

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文学评论 2024年第1期 88-96页

作者：郭玉婵清华大学中文系

“无器官的身体”几乎成了德勒兹身体哲学中的一个关键概念,他用“无器官的身体”表达异质和连接原则下运动着的身体形象,它既不同于笛卡尔机械论式的身体,也不同于梅洛一庞蒂知觉现象学中的“肉”,“身体”成了一个离弃了自我而自发地... 详细信息

“无器官的身体”几乎成了德勒兹身体哲学中的一个关键概念,他用“无器官的身体”表达异质和连接原则下运动着的身体形象,它既不同于笛卡尔机械论式的身体,也不同于梅洛一庞蒂知觉现象学中的“肉”,“身体”成了一个离弃了自我而自发地运动和变化着的形象。然而,“无器官的身体”这个概念首先来自阿尔托,阿尔托创造出“无器官的身体”作为原初身体的一个复象,恰恰是为了反对身体的自动机。这一点说明了德勒兹对阿尔托的“误读”,他将阿尔托“无器官的身体”引向了柏格森的“绵延”概念。阿尔托已经预见到德勒兹式的流变的身体可能使身体陷入机械论的危险,而阿尔托通过书写回溯至自我身体的发源地,制造出作为复象的“无器官的身体”,意图把“身体”从所有自动机制中解救出来,恢复“身体”的自由。

关键词：安托南·阿尔托德勒兹无器官的身体复象生成