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保加利亚乳杆菌CcpA基因的敲除及其抗胁迫能力的研究

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保加利亚乳杆菌CcpA基因的敲除及其抗胁迫能力的研究

作者：孙金威东北农业大学

学位级别：硕士

在乳酸菌发酵剂的生产过程中,乳酸菌会遇到冷冻、干燥和高渗等不利条件的影响,造成乳酸菌细胞膜损伤和破坏、细胞衰亡、失去活性、导致发酵剂产品质量降低,这些不利条件对乳酸菌的胁迫已经成为制约其工业化的瓶颈。乳酸菌在变化的环境... 详细信息

在乳酸菌发酵剂的生产过程中,乳酸菌会遇到冷冻、干燥和高渗等不利条件的影响,造成乳酸菌细胞膜损伤和破坏、细胞衰亡、失去活性、导致发酵剂产品质量降低,这些不利条件对乳酸菌的胁迫已经成为制约其工业化的瓶颈。乳酸菌在变化的环境中能通过改变自身代谢增强对外界环境的抵抗力。研究发现,碳分解代谢阻遏蛋白Ccp A能够调控诸多应激反应蛋白,是微生物抗胁迫的重要调控因子。因此,本研究重点分析Ccp A缺失对保加利亚乳杆菌的影响,通过对比野生菌和突变菌在生长代谢、关键酶活以及抗胁迫方面的变化,探讨Ccp A与菌株抗胁迫的关系,为下一步抗胁迫机理的研究做铺垫。本研究以德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ***)ATCC11842为研究对象。利用同源重组的方法获得Ccp A突变菌株,分别从生长代谢、关键酶活和抗逆性进行对比分析。通过高效液相色谱法分析葡萄糖和有机酸代谢情况,通过分光光度法和比色法分析关键酶活性变化情况。研究结果显示:Ccp A基因缺失后,德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC 11842的生长受到抑制。与原始菌株(野生菌)相比,在相同条件下培养时,Ccp A突变菌进入稳定期的时间比野生菌迟缓4h左右,均步入稳定期后,Ccp A突变菌的菌体密度比野生菌低23.08%。Ccp A缺失对葡萄糖消耗速率有一定的影响。有氧培养时,野生菌的葡萄糖消耗速率比突变菌高15.30%(P<0.05),无氧培养时则高7.98%(P<0.05);对同一菌株而言,有氧培养时对葡萄糖的消耗均大于无氧培养,其中野生菌为5.47%(P<0.05),突变菌为12.62%(P<0.05)。另外,Ccp A缺失对乳酸和乙酸的生成速率也有一定的影响。有氧培养时,野生菌的乳酸生成速率比突变菌高47.62%(P<0.05),无氧培养时野生菌的乳酸生成速率比突变菌高21.87%(P<0.05);对同一菌株而言,无氧培养时乳酸生成速率均大于有氧培养,其中野生菌为23.94%(P<0.05),突变菌为50.13%(P<0.05)。对乙酸而言,有氧培养时,突变菌的乙酸生成速率比野生菌高47.73%(P<0.05),无氧培养时两者差异不显著。通过对比分析野生菌和突变菌的糖酵解途径关键酶活性的变化得出,在有氧条件下,Ccp A突变菌的胞内乳酸脱氢酶的活力比野生菌的胞内乳酸脱氢酶的活力降低了72.22%(P<0.05),磷酸果糖激酶活力降低了60.07%(P<0.05),丙酮酸激酶活力降低了70.58%(P<0.05);无氧条件下,其胞内乳酸脱氢酶活力降低了36.75%%(P<0.05),磷酸果糖激酶活力降低了62.87%(P<0.05),丙酮酸激酶活力降低了29.05%(P<0.05)。无论是有氧培养还是无氧培养,Ccp A缺失后乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性均显著降低,说明Ccp A蛋白参与这三种酶的激活调控,当Ccp A缺失后,三种酶的活性下降。Ccp A缺失后,菌体的耐热性下降,菌体密度只有原对照组的3.14%(P<0.05)。在不同培养条件下Ccp A突变菌对冷的耐受性不同。有氧培养时,02d内突变菌的菌体密度是野生菌的48.42%;无氧培养时,突变菌的菌体密度只有野生菌的8.16%。对同一菌株而言,有氧培养时菌体耐冷性均比无氧培养时高,其中野生菌高出7.93%(P<0.05),突变菌则高出91.52%(P<0.05)。研究结果表明:利用同源重组的方法分别构建Ccp A敲除载体p CT和打靶片段,将敲除载体p CT和打靶片段电转化至德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842中,成功获得Ccp A基因缺失的突变菌。实验表明,Ccp A突变菌的乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性下降显著,糖酵解途径关键酶活的下降直接导致糖酵解途径减弱,进而出现葡萄糖利用率降低和生长速率下降的现象,由此推断,Ccp A蛋白是糖酵解关键酶调控的总因子;对野生菌而言,有氧培养和无氧培养时的酶活差异显著;而突变菌酶活性差异不显著,推断Ccp A参与了菌体呼吸链的调控。Ccp A突变菌的耐热性和耐冷性显著下降,抗氧化损伤能力显著提高,推断Ccp A参与热激蛋白和冷激蛋白的正调控,参与抗氧化蛋白的负调控。

关键词：保加利亚乳杆菌 Ccp A 基因敲除生长代谢酶活性

德式乳杆菌保加利亚亚种分解代谢控制蛋白CcpA基因敲除突变株的构建

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中国食品学报 2016年第6期16卷 57-63页

作者：孙金威刘丽波祁昕杨鹤龚娅莉李春东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030

在革兰氏阳性菌中,分解代谢控制蛋白(Ccp A)是一种参与碳代谢和氮代谢的多效调控蛋白。利用同源重组技术,以德式乳杆菌保加利亚亚种为研究对象,构建Ccp A基因敲除突变株。首先以德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842基因组DNA和质粒p BR322... 详细信息

在革兰氏阳性菌中,分解代谢控制蛋白(Ccp A)是一种参与碳代谢和氮代谢的多效调控蛋白。利用同源重组技术,以德式乳杆菌保加利亚亚种为研究对象,构建Ccp A基因敲除突变株。首先以德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842基因组DNA和质粒p BR322为模板,扩增Ccp A基因和四环素抗性基因(Tet),然后分别将Ccp A基因和Tet基因连接到载体p Back Zero-T Vector上,再对中间载体p Back Zero-Ccp A和p Back Zero-Tet进行双酶切,回收纯化双酶切后的目的片段并连接获得Ccp A基因敲除的重组载体p CT。通过同源重组筛选Ccp A基因敲除突变株,菌落PCR和测序鉴定结果均显示Ccp A基因敲除突变株构建成功,这为阐明该调控蛋白在德式乳杆菌保加利亚亚种代谢过程中的作用奠定了基础。

关键词：分解代谢控制蛋白德式乳杆菌保加利亚亚种基因敲除突变株

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丙酮酸钠与流加发酵结合对唾液酸产量的影响

中国食品学报 2015年第7期15卷 154-159页

作者：李春王敏戚晓熙孙金威刘丽波刘宁东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030 东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030

利用微生物发酵法生产唾液酸,凭借其原料价格低廉,唾液酸收率高,产品质量稳定,易于实现连续化生产等优势而备受关注。探讨不同含量的前体物质丙酮酸钠对大肠杆菌K235发酵产唾液酸的影响,以及结合流加发酵进一步提高终产物产量的策略。... 详细信息

利用微生物发酵法生产唾液酸,凭借其原料价格低廉,唾液酸收率高,产品质量稳定,易于实现连续化生产等优势而备受关注。探讨不同含量的前体物质丙酮酸钠对大肠杆菌K235发酵产唾液酸的影响,以及结合流加发酵进一步提高终产物产量的策略。以唾液酸质量浓度和菌体干质量为参数,通过单因素试验和一次性补料方法分别确定丙酮酸钠的最佳添加量和最佳补料期。试验结果表明,用三口烧瓶模拟发酵罐,在发酵初期添加4 g/L的丙酮酸钠,其发酵液经酸水解后,唾液酸产量达到4.10 g/L。用3.7 L自动生物发酵罐验证,唾液酸产量达到5.24 g/L,比不添加丙酮酸钠时唾液酸的产量提高了146%。丙酮酸钠在发酵8 h时一次性补料,发酵罐中唾液酸的产量达到6.47 g/L,比在单一的分批培养模式中添加丙酮酸钠提高了23.5%。

关键词：丙酮酸钠唾液酸产量流加发酵

NaCl刺激保加利亚乳杆菌对丙酮酸代谢及相关酶活性的影响

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中国科技论文 2014年第9期9卷 1043-1048页

作者：李培照孙金威刘丽波梁婉婷祁昕李春东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030

分析NaCl刺激保加利亚乳杆菌与冻干存活率的关系。高效液相色谱法分析葡萄糖、有机酸、乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)以及胞内能量代谢变化;顶空气相色谱法测定乙醛含量;分光光度法和比色法测定关键酶活性。结果显示:NaCl刺激保加利亚乳杆菌对... 详细信息

分析NaCl刺激保加利亚乳杆菌与冻干存活率的关系。高效液相色谱法分析葡萄糖、有机酸、乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)以及胞内能量代谢变化;顶空气相色谱法测定乙醛含量;分光光度法和比色法测定关键酶活性。结果显示:NaCl刺激保加利亚乳杆菌对丙酮酸的代谢有显著影响,葡萄糖代谢速率提高48.18%(P<0.01),乳酸生成速率提高8.93%(P<0.01),关键中间代谢产物Acetyl-CoA的含量增加约31.35%(P<0.01);而乙酸含量出现负增长,乙醛生成速率降低22.86%(P<0.05)。胞内ATP代谢变化明显促进糖代谢速率;乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰转移酶的活性均有增加,而乙醛脱氢酶活性减弱。结果表明,NaCl刺激保加利亚乳杆菌对自身糖代谢的加快,丙酮酸代谢碳流向的重新分配以及关键酶活性的改变,可能与提高保加利亚乳杆菌的冻干存活率相关。

关键词：保加利亚乳杆菌 NaCl刺激丙酮酸代谢能量代谢酶活性

益生菌包埋晶球的体外耐受性及其应用特性研究

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中国乳品工业 2022年第6期50卷 22-27页

作者：曹珺刘绒梅罗力文孙金威吴华星吕雪鹏高达李启明乳品营养与功能四川省重点实验室成都610000 新希望乳业股份有限公司成都610000 四川省优质乳品制备与质量控制技术工程实验室成都610000

对鼠李糖乳杆菌grx10、副干酪乳杆菌Lpc37被包埋前后的益生菌粉和益生菌晶球进行体外胃肠液耐受实验及监测与酸奶混合后的性质变化的结果表明,被包埋后的grx10和Lpc37对消化道恶劣环境的抵抗力显著提升,且益生菌晶球与酸奶混合后不会产... 详细信息

对鼠李糖乳杆菌grx10、副干酪乳杆菌Lpc37被包埋前后的益生菌粉和益生菌晶球进行体外胃肠液耐受实验及监测与酸奶混合后的性质变化的结果表明,被包埋后的grx10和Lpc37对消化道恶劣环境的抵抗力显著提升,且益生菌晶球与酸奶混合后不会产生显著的相互影响。晶球与菌粉相比,经pH值为2.5的人工胃液处理3.0 h后grx10和Lpc37的活菌数分别提升4.4和5.2个数量级,经质量分数为0.3%的胆汁盐处理4.5 h后grx10和Lpc37的活菌数分别提升4.2和1.7个数量级;益生菌晶球与酸奶混合后的晶球酸奶在21 d内pH值、酸度及活菌数与对照组相比无显著性差异,可见益生菌被包埋后与外环境的接触减少从而避免相互影响,因此益生菌晶球能在增加酸奶中益生菌含量和食用趣味性的前提下保持酸奶原有风味。

关键词：益生菌晶球乳酸菌包埋体外耐受性

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传统乳制品中乳酸菌的筛选及发酵性能研究

中国酿造 2022年第5期41卷 78-83页

作者：刘绒梅高达孙金威吕雪鹏曹珺罗力文徐飞鸿魏枫染李启明新希望乳业股份有限公司四川成都610063 乳品营养与功能四川省重点实验室四川成都610063 四川省优质乳品制备与质量控制技术工程实验室四川成都610063

为获得优良发酵性能的乳酸菌,采用传统培养方法从传统发酵乳样品中分离乳酸菌,并将分离菌株制备发酵乳。通过考察发酵乳的感官品质筛选优良菌株,采用形态学观察及16S rDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定;并对其生长性能、产酸性能及其制备... 详细信息

为获得优良发酵性能的乳酸菌,采用传统培养方法从传统发酵乳样品中分离乳酸菌,并将分离菌株制备发酵乳。通过考察发酵乳的感官品质筛选优良菌株,采用形态学观察及16S rDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定;并对其生长性能、产酸性能及其制备发酵乳贮藏期内品质变化进行测定。结果显示,共分离得到67株乳酸菌,筛选出5株性能较佳的菌株(编号为C-1、Q164、Q165、Q166和Q167),均被鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。其中,菌株C-1生长性能和产酸性能最佳,该菌株制备的发酵乳奶香明显,口感细腻顺滑,感官评分最高(93.5分),30℃贮藏21 d后,酸度为86.0°T,活菌数为7.2×10^(3)CFU/g。综上,嗜热链球菌C-1具备优良发酵性能菌株的应用潜力。

关键词：传统乳制品乳酸菌筛选分离鉴定发酵性能

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新鲜奶酪球的加工工艺研究及品质测定

中国乳品工业 2023年第8期51卷 57-64页

作者：徐飞鸿安保森付永猛孙金威范光彩冉然钱成林宋艳梅李启明乳品营养与功能四川省重点实验室四川省优质乳品制备与质量控制技术工程实验室新希望乳业股份有限公司成都610000 成都分子力量生物科技有限公司成都610000 青岛新希望琴牌乳业有限公司山东青岛266000

研究了脂肪蛋白质比(FPR)为0.35~1.18的牛乳及热烫水分为70%~85%的凝乳对新鲜奶酪球的工艺、内容物、质构及感官品评的影响。通过测定发酵曲线,采用DoseResp模型,比较FPR对发酵速率和酸化程度的影响。结果表明FPR 0.35发酵速率和酸化程... 详细信息

研究了脂肪蛋白质比(FPR)为0.35~1.18的牛乳及热烫水分为70%~85%的凝乳对新鲜奶酪球的工艺、内容物、质构及感官品评的影响。通过测定发酵曲线,采用DoseResp模型,比较FPR对发酵速率和酸化程度的影响。结果表明FPR 0.35发酵速率和酸化程度显著最低;增加FPR,可提升奶酪的内容物含量,产率、感官整体接受程度和口感顺滑度;降低酸度和硬度;但不会影响质构回复性和内聚力,感官香气、酸感和甜度。在热烫过程中,凝乳的酸度与水分呈负相关。降低凝乳中的水分,可提升奶酪的酸感和顺滑度,降低内聚力,但对内容物、产率、硬度、回复性、整体接受程度、香气和甜度没有显著影响。因热烫的浓缩作用,乳清中的除脂肪外的内容物和酸度会增加。

关键词：新鲜奶酪球脂肪蛋白质比热烫凝乳工艺研究

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马克思情感观及其当代价值研究

马克思情感观及其当代价值研究

作者：伍金威电子科技大学

学位级别：硕士

情感从未像今天这般突显。人彼此间的冷漠与对物的变态狂热,同时弥漫在社会中,而学术界整体的“情感转向”,更表征着情感已然成为时代症候。时代需要一种理论去理解情感,并且提供可能性解决。马克思主义具有与时俱进的生命力与批判精神... 详细信息

情感从未像今天这般突显。人彼此间的冷漠与对物的变态狂热,同时弥漫在社会中,而学术界整体的“情感转向”,更表征着情感已然成为时代症候。时代需要一种理论去理解情感,并且提供可能性解决。马克思主义具有与时俱进的生命力与批判精神,而马克思更是身处情感异化初露端倪的年代,却用自己的一生达到了生命情感的和谐圆满。于是回到马克思所处的年代,回到马克思富有激情的文字书写,回到马克思跌宕起伏的一生,寻找解答的新可能,也就成为必然的选择。文章以马克思关于情感的相关论述为文本基础,遵循历史与逻辑相统一的原则,沿着“生成回顾—内容构建—逻辑重塑—价值呈现”的写作思路,梳理出马克思情感观的整体内容。首先,深入挖掘马克思情感观形成的诸多因素:时代背景、思想来源、个人实践,其次,从不同时期的具体文本出发,归纳出马克思情感观的发展脉络,从中解析出马克思对情感理解由浅入深、由表及里的思考进程。再次,以情感的生成与本质、结构与功能、异化与解放等三个维度对马克思情感观的主体内容进行深度构建。然后,在认识马克思情感观的主要内容的基础上,探讨其内在逻辑以及基本特征,以现实的人为逻辑起点,沿着人的生存情感与生命情感之间的对立冲突的主线,最终实现人的完整。最后,则是把马克思情感观形成的理论放置于当下的时代,去讨论马克思情感观所展现出的理论与实践价值,在理论层面,丰富与完善了马克思主义人学内涵,启示了马克思主义心理学的理论构建,拓展了情感研究的新视角。同时在实践层面,它为解决现代的人的情感困境提供价值启示,为情感教育提供科学准则,为构建新时代美好生活贡献实践指引。

关键词：马克思情感观情感异化完整的人

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希腊酸奶工艺及乳清利用研究进展

食品与发酵科技 2018年第5期54卷 75-79页

作者：郑玮丽屈小玄孙金威康红彦河北新希望天香乳业有限公司河北071000

随着消费升级的驱动,消费者对优质天然营养食品的摄取日益重视,这也为酸奶市场带来新一轮契机。希腊酸奶由于其丰富的营养和细腻浓密的口感进入了大家的视线。本文将从希腊酸奶的发展现状、生产工艺、副产品乳清的利用等方面进行阐述,... 详细信息

随着消费升级的驱动,消费者对优质天然营养食品的摄取日益重视,这也为酸奶市场带来新一轮契机。希腊酸奶由于其丰富的营养和细腻浓密的口感进入了大家的视线。本文将从希腊酸奶的发展现状、生产工艺、副产品乳清的利用等方面进行阐述,以期对希腊酸奶的研制开发提供一定的理论基础。

关键词：希腊酸奶脱乳清高蛋白