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丛枝菌根真菌对垂穗披碱草吸收有机氮的研究

丛枝菌根真菌对垂穗披碱草吸收有机氮的研究

作者：孙永芳西北农林科技大学

学位级别：硕士

由于青藏高原地区海拔高,气温低等因素限制了土壤有机氮的矿化,导致土壤氨基酸浓度超过矿质氮(NH4+,NO3-)浓度,菌根共生体可极大地促进植物对氮素的吸收和利用,其中菌根真菌对氮素的吸收是植物氮吸收的一个重要途径。因此,本研究选择丛... 详细信息

由于青藏高原地区海拔高,气温低等因素限制了土壤有机氮的矿化,导致土壤氨基酸浓度超过矿质氮(NH4+,NO3-)浓度,菌根共生体可极大地促进植物对氮素的吸收和利用,其中菌根真菌对氮素的吸收是植物氮吸收的一个重要途径。因此,本研究选择丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)接种青藏高原的建群种垂穗披碱草(Elymus nutans)根系,采用石英砂作为植物生长的介质,通过丛枝菌根真菌在不同氮源营养液中的应用,探讨丛枝菌根真菌对不同氮源条件下垂穗披碱草的生长和生理方面的影响。主要结果如下:(1)高海拔地区的垂穗披碱草对谷氨酸的吸收能力较强,而对天冬氨酸和甘氨酸的吸收较弱。当谷氨酸作为氮源时,北京正道的垂穗披碱草(BJ)对氮的吸收能力最弱,采自野生型申扎垂穗披碱草(SZ)对氮的吸收能力最强,且适宜的氨基酸浓度为2.0mmol/L。(2)接种丛枝菌根真菌的垂穗披碱草均受到了不同程度的感染,且2份垂穗披碱草的侵染率随着侵染时间的延长呈现先增加后下降的趋势。当单独利用有机氮或无机氮作为氮源时,接种激活丛枝菌根真菌均能增加2份垂穗披碱草的根系总根长和总根表面积,提高2份垂穗披碱草的根系生物量和根系活力。接种丛枝菌根真菌均能增加2份垂穗披碱草的地上生物量,且对SZ的提高幅度更大。(3)当有机氮或无机氮作为氮源时,接种丛枝菌根真菌能显著提高2份垂穗披碱草的地上生物量、叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素、总氮、总游离氨基酸、可溶性蛋白的含量和硝酸还原酶的活性,但对植株的叶绿素a/b的比值、硝态氮含量和谷氨酰氨合成酶活性的效果不大,甚至有抑制作用。(4)当有机氮作为氮源时,2份垂穗披碱草生长均受到了一定的影响,且(BJ)受到的影响较大。接种激活的丛枝菌根真菌能均降低2份垂穗披碱草的电解质渗出率和丙二醛(MDA)含量,降低了2份垂穗披碱草的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性。总之,不接种丛枝菌根真菌与接种灭活的丛枝菌根真菌对垂穗披碱草影响不大,接种激活的丛枝菌根真菌提高了垂穗披碱草的生物量、促进了垂穗披碱草对氮源的吸收,降低了垂穗披碱草在有机氮作为唯一氮源条件下的生长抑制作用。

关键词：丛枝菌根真菌垂穗披碱草谷氨酸氮

猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定分析

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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定分析

作者：孙永芳中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、致死性传染病。在CSFV编码的结构蛋白中,E2囊膜蛋白作为CSFV主要免疫原性蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,是新型疫苗的主要研究... 详细信息

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、致死性传染病。在CSFV编码的结构蛋白中,E2囊膜蛋白作为CSFV主要免疫原性蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,是新型疫苗的主要研究对象,也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。以CSFV E2蛋白作为免疫原制备的单克隆抗体具有病毒中和能力,在CSFV的生物学特性、抗原性及表位研究、免疫学诊断、流行病学研究等方面具有重要的应用价值。已有研究证明E2蛋白上存在多个抗原表位,包括线性表位和构象表位。为进一步对E2蛋白表位进行定位和分析,本研究采用杆状病毒表达猪瘟病毒C株E2蛋白作为免疫原蛋白,免疫BABL/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得4株抗CSFV E2蛋白单抗,分别命名为E2-1,E2-2,E2-3,E2-4。经测定4株单抗均属于IgG1亚型,轻链为κ链。制备腹水并纯化单抗,鉴定结果显示4株单抗抗体效价分别为1:102400、1:102400、1:204800、1:102400,而且均能与猪瘟C株发生反应,与BVDV无交叉反应,均能中和CSFV Thiveral株,其中单抗E2-3与Thiveral株的中和效价高达1.6×105倍。为进一步鉴定单抗识别的抗原表位,从所筛选的4株单克隆抗体中,选择病毒中和活性和效价最高的单抗E2-3进行表位鉴定。本实验采用PEPperMAP?表位图谱技术,按照猪瘟病毒C株E2全长(除跨膜区),用多肽重置的方法人工合成314条长度为15个氨基酸的多肽,制备多肽芯片,用单抗E2-3进行反应,发现存在一条9个氨基酸的特异性多肽序列(正在申请国家专利)与单抗E2-3特异性结合,且与国际上著名的单抗WH303表位(TAVSPTTLR)不在同一位点。为进一步确定该表位的关键氨基酸位点,本研究对筛选出来的特异多肽序列,采用氨基酸替换实验,将表位中氨基酸逐一替换,制备多肽芯片,与单抗E2-3反应分析。结果显示单抗E2-3与酸性氨基酸(D、E)和芳香族氨基酸(W、Y)亲和能力较强,而抗原表位中存在3个天冬氨酸(D)与之对应。因此推测该表位中的3个D可能为关键的结合位点。为了验证表位中的3个D是否为关键的结合位点,本实验在多肽水平表位鉴定的基础上进一步了研究3个D的作用机制。利用杆状病毒表达系统进行关键氨基酸突变表达试验,在杆状病毒CSFV E2蛋白转移载体上对3个D分别进行单一突变、双突变、三突变,对表达产物进行反应鉴定。结果显示单抗E2-3与突变后表达产物结合能力并未出现明显的下降,推测这3个D位点可能并不是关键氨基酸位点,而是由多个氨基酸位点共同决定,其作用机制还需进一步研究。为了确定单抗E2-3与不同基因亚型CSFV广谱性,实验中复壮分离了22株CSFV流行毒株,并对其进行E2基因主要编码区序列分析。发现22株流行毒株分属1.1、2.1和2.2三个基因亚型,并以2.1基因亚型毒株为主。而对22株CSFV流行毒株与单抗E2-3进行反应性分析后发现,单抗E2-3与三个基因亚型毒株均发生反应,证明单抗E2-3具有广谱性,但只与9株2.1亚型毒株不发生反应,说明不同流行毒株之间存在一定抗原谱差异。综上所述,本研究制备了4株特异性抗CSFV E2蛋白单克隆抗体,均具有病毒中和活性。对其中的一株抗体效价最高的单抗E2-3进行抗原表位鉴定,确定了一个不同于国际上著名的单抗WH303的线性表位(正在申请专利);采用氨基酸替换和突变研究,发现鉴定表位中的3个D并不是关键位点,推测可能是由多个氨基酸共同影响单抗E2-3的结合能力;同时,通过该单抗E2-3与不同流行毒株反应性分析,证明CSFV流行毒株具有不同的抗原谱。

关键词： CSFVE2蛋白单克隆抗体抗原表位

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基于喷墨打印的重金属离子纸基传感技术研究

基于喷墨打印的重金属离子纸基传感技术研究

作者：孙永芳湖南大学

学位级别：硕士

重金属离子的污染正在严重威胁着人类的生活,因此非常有必要发展一种快速而准确检测重金属离子的方法,使人类尽量远离重金属离子的污染。纸基微流控分析是一种以纸张作为基底材料的分析检测技术,具有成本低、操作简单、便携性好、可一... 详细信息

重金属离子的污染正在严重威胁着人类的生活,因此非常有必要发展一种快速而准确检测重金属离子的方法,使人类尽量远离重金属离子的污染。纸基微流控分析是一种以纸张作为基底材料的分析检测技术,具有成本低、操作简单、便携性好、可一次性使用等优点,在生命科学、环境分析和医疗健康等领域引起了很大的关注,已经成功应用于疾病诊断、环境监测和食品质量控制等诸多领域。其中,纸芯片结合了传统微流控芯片的优点(微型化、高通量、高度集成化等)和纸张的独特优势(廉价易得、生物相容性好、无需外加动力等),其发展已经从制作方法的探究深入到实际应用中。比色法、电化学法、化学发光法、电化学发光法、荧光法等分析方法在纸芯片中均得到应用。将纸基微流控分析即纸芯片和喷墨打印法,以及传统的光分析法(比色法,荧光法)相结合起来,具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、选择性好、微型化、易携带、重现性好等优势,正在广泛用于分析检测的各个方面。本文提出用于溶液中和纸基上两个方式分别进行荧光检测重金属离子镉和比色检测重金属离子银,成功地用于重金属离子镉和银的微量检测。主要工作如下:(1)在我国南方,镉离子造成的镉大米污染为人们的健康生活造成了很大的危害。我们采用8-羟基喹啉和2,6-双(氯甲基)吡啶为原料合成了一种有机小分子染料2,6-二(8'-喹啉氧基甲基)吡啶,用于镉离子的检测分析。这种有机小分子染料本身有弱的荧光,当金属离子Cd2+存在的时候,二者能够发生配位反应,产生荧光增强,通过这一信号变化,达到检测金属离子Cd2+的目的。基于该原理,我们首先在液相中进行反应,发现金属离子Cd2+与有机小分子反应灵敏度高,选择性好。为了更好地用于纸基微流控分析上的分析检测,我们探究了该染料和金属离子Cd2+在溶液中反应所需要的反应条件,如pH值,络合时间等,最终配制了适宜pH值、适宜的粘度和表面张力的墨水用于喷墨打印,然后使用智能手机作为信号收集装置,拍摄反应后的荧光图片,并用ImageJ软件将图片颜色转变为灰度值,根据灰度值大小与金属离子Cd2+之间的浓度关系进行分析。(2)为了准确检测金属离子Ag+的浓度大小,我们以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为反应的底物,当金属离子Ag+存在的情况下,TMB能被金属离子Ag+直接从无色氧化成蓝色,基于这一原理,我们首先在溶液中进行反应,得到了很好的线性关系,选择性和灵敏度,以及比较适宜的反应条件,然后配制一定浓度的TMB溶液作为打印的墨水,打印在事先处理好的纸基微流控通道内,经过一段的时间反应后,发现试纸上的颜色由无色变成蓝绿色,这一现象作为检测的标准,然后使用智能手机作为信号收集装置,拍摄反应后的图片的颜色,并用ImageJ软件将图片颜色转变为灰度值,根据灰度值与金属离子Ag+的浓度关系进行半定量分析。该方法可由颜色深浅对应得到金属离子Ag+的浓度大小,可以方便地进行裸眼观察,或者可以采用人们手中的手机直接方便地拍摄出检测结果。

关键词：纸微流控分析喷墨打印金属离子Cd2+ 金属离子Ag+

高能窄谱红光治疗对慢性难愈性创面模型大鼠bFGF和VEGF生长因子表达的影响

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高能窄谱红光治疗对慢性难愈性创面模型大鼠bFGF和VEGF生长因子表...

作者：孙永芳兰州大学

学位级别：硕士

目的：研究高能窄谱红光治疗对慢性难愈性创面模型大鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：将45只大鼠随机分为创伤模型无照射组、640 nm红光短时照射组(30min)和长时照射组(60 min),每组15只。使... 详细信息

目的：研究高能窄谱红光治疗对慢性难愈性创面模型大鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：将45只大鼠随机分为创伤模型无照射组、640 nm红光短时照射组(30min)和长时照射组(60 min),每组15只。使用10%的水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉(300 mg/kg),在脊柱两侧使用环形钻形成4个直径为10 mm的圆形创面。调节640 nm半导体激光器的输出光功率,本实验照射时间分别为每次30 min及60 min,每日1次,总14次。照射时大鼠被照部位与光束的相对位置每次均保持完全相同。每2日创面拍照,用计算机图像分析软件Image-ProPlus 6.0软件测量创面面积,共8次,计算出创伤面收缩率。分别在治疗的第3天、第7天、第14天处死大鼠,切取伤口组织,浸泡于25%的福尔马林溶液中定型24小时,石蜡切片,常规HE染色,光镜下对比观察。石蜡切片的bFGF、VEGF进行免疫组化染色检测,采集免疫组化切片的数码照片,计算表达面积。以图象处理软件Motic pro5.0分析并计算创面面积,计算愈合率。结果：重复测量方差分析结果表明,30 min照射组、60 min照射组与无照射组相比较,创面面积愈合率差异有统计学意义(P0.05)。640 nm红光长时照射组和短时照射与模型组比较VEGF的表达量均存在显著差异(P0.05)结论：高能窄谱红光治疗有明显的促进创面愈合作用,其能提高愈合速度,改善愈合质量,其促进创面愈合的机理可能与其调节皮肤创面组织中bFGF及VEGF的表达有关。

关键词：高能窄谱红光治疗慢性难愈性创面 bFGF VEGF

上市公司业绩预告异常“变脸”研究——以沃森生物为例

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上市公司业绩预告异常“变脸”研究——以沃森生物为例

作者：孙永芳河南大学

学位级别：硕士

业绩预告制度建立的初衷是为了缓解信息不对称带来的问题,缓解上市公司与投资者之间的信息不对称,保护投资者的权益,提高证券市场的透明度。从1998年开始我国实行业绩预告制度,历经数十年的发展,逐渐趋于稳定。从前人的研究来看,业绩预... 详细信息

业绩预告制度建立的初衷是为了缓解信息不对称带来的问题,缓解上市公司与投资者之间的信息不对称,保护投资者的权益,提高证券市场的透明度。从1998年开始我国实行业绩预告制度,历经数十年的发展,逐渐趋于稳定。从前人的研究来看,业绩预告确实能够提前释放业绩风险,且能够为投资者进行投资决策提供重要依据。但是业绩预告在发展的过程中也发生异化,一些上市公司出现业绩预告发布不及时、信息披露不够准确、业绩预告质量不高等,更有甚者业绩预告出现频繁变更、修正,时而发生盈利、时而发生亏损等现象,这些异化现象不仅是对业绩预告制度严肃性、规范性的挑战,而且会误导投资者,给投资者造成巨大损失,使业绩预告成为一些人操纵股价、危害证券市场的工具,使人对业绩预告制度的作用产生怀疑。本文基于信息不对称、委托代理以及有效市场假说的理论基础,以云南沃森生物技术股份有限公司的业绩预告“变脸”现象为研究对象,进行分析探究。首先,对业绩预告“变脸”的过程进行回顾,对涉及到的方面进行介绍。其次,对业绩预告“变脸”的动机进行分析,从公司所处的行业、业绩预告制度本身缺陷以及公司内部治理方面揭露其影响因素。从行业方面来看,主要有政策、竞争、药品质量以及资金投入方面的影响;从业绩预告制度方面来看,主要有业绩预告未经注册会计师审计、信息披露违规成本较低以及相关责任主体不明确的影响;从公司治理方面来看,主要有公司内部人员未尽职尽责,内部控制可能存在问题的影响。然后,对业绩预告“变脸”造成的后果进行分析,主要是对公司的股价造成波动,给投资者造成重大损失;业绩预告“变脸”事件引发了较多负面报道,对公司的形象造成了不良影响;破坏市场的稳定性,危害证券市场健康发展。文章从公司内部治理、业绩预告制度、加强外部监管以及投资者角度提出如何防范业绩预告“变脸”。为减少业绩预告“变脸”现象,完善业绩预告制度,提高业绩预告披露质量,保护投资者权益,维护证券市场健康有序发展提供一些建议。

关键词：业绩预告业绩预告“变脸” 沃森生物投资者