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翘嘴鳜microRNA转录组分析及生长相关miRNA鉴定

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基因组学与应用生物学 2017年第2期36卷 603-613页

作者：王博田园园孙成飞董浚键叶星农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380 上海海洋大学水产与生命技术学院上海201306

MicroRNAs(mi RNAs)是一类内源性、长度约22 nt的非编码小RNA,通过转录后调控基因的表达水平、参与生物体的生长与发育等多种生理过程。翘嘴鳜是我国淡水经济鱼类,由于长期人工繁殖忽视亲本选育,导致鳜种质退化,出现生长速度及抗病力下... 详细信息

MicroRNAs(mi RNAs)是一类内源性、长度约22 nt的非编码小RNA,通过转录后调控基因的表达水平、参与生物体的生长与发育等多种生理过程。翘嘴鳜是我国淡水经济鱼类,由于长期人工繁殖忽视亲本选育,导致鳜种质退化,出现生长速度及抗病力下降等问题。本研究中,我们以生长存在显著差异的慢长组和快长组翘嘴鳜肌肉为材料,通过HiSeq 2000深度测序技术和生物信息学分析miRNA转录组,鉴定出433个已知miRNAs并分析miRNAs种子编辑情况。Expdiff方法结合qPCR验证试验,证实了4个表达显著差异的mi RNAs:miR-122、miR-192、miR-451、let-7j-5p。对差异miRNAs进行靶基因预测并通过KEGG Pathway显著性富集分析,发现差异miRNA参与生长、发育、代谢、信号转导等途径,其中Wnt信号通路等在肌肉的生长发育过程起重要作用。本研究为进一步开展miRNA-靶基因的交互作用、了解其对鳜鱼生长的调控机制奠定了基础,并可为鳜鱼分子选育种提供候选基因。

关键词：翘嘴鳜生长差异microRNA 肌肉深度测序技术

尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆、结构分析及组织表达

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南方水产科学 2017年第1期13卷 85-93页

作者：余嘉欣吴芳孙成飞董浚键田园园叶星中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

γ-干扰素(interferon,IFN)是调控天然免疫与细胞免疫的一种重要细胞因子,在抵抗病毒入侵和细菌感染中发挥重要作用。该研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的c DNA,大小为621 bp,编码206个氨基酸。... 详细信息

γ-干扰素(interferon,IFN)是调控天然免疫与细胞免疫的一种重要细胞因子,在抵抗病毒入侵和细菌感染中发挥重要作用。该研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的c DNA,大小为621 bp,编码206个氨基酸。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼γ-干扰素分子(On IFNγ)具有信号肽、IFN特征序列及核定位信号。预测的三级结构与人类IFNγ晶体结构最相似。q PCR检测显示,IFNγ在正常鱼体内的脾脏中表达量最高,其次是肠、鳃和肾脏。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,On IFNγ在脾脏、肾和鳃中的表达均显著上调(P<0.05)。On IFNγ在相关免疫器官中的高表达、受感染后的表达上调,说明其在罗非鱼免疫防御中可能具有重要作用。该研究为进一步开展On IFNγ基因的功能研究、探讨其在抗病转基因及抗病选育中的开发应用奠定了基础。

关键词：尼罗罗非鱼 γ-干扰素序列分析结构分析生物信息学组织分布

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翘嘴鳜微卫星标记亲权鉴定技术的建立与应用

农业生物技术学报 2017年第6期25卷 976-984页

作者：曾庆凯孙成飞董浚键田园园叶星中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用鱼养殖重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）是中国重要的淡水优质养殖鱼类。为鉴定翘嘴鳜选育群体系谱,比较双酶切限制性酶切位点关联DNA测序（double digest restriction-site associated DNA sequencing,ddRADseq）与微卫星标记两种方法的鉴定效果... 详细信息

翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）是中国重要的淡水优质养殖鱼类。为鉴定翘嘴鳜选育群体系谱,比较双酶切限制性酶切位点关联DNA测序（double digest restriction-site associated DNA sequencing,ddRADseq）与微卫星标记两种方法的鉴定效果,并建立翘嘴鳜亲权鉴定技术,本研究根据GenBank上的微卫星序列,设计并筛选11对具有特异性和多态性的引物,在4个已知系谱信息的全同胞家系扩增、分型与验证。聚类结果显示,这11对微卫星引物可将这4个全同胞家系分成4个支,与实际系谱情况相符。利用ddRAD-seq获得3 283个SNP标记,构建包含155个同胞个体以及12个其他非同胞个体的聚类树,这12个非同胞个体可被有效区分。采用以上11对微卫星引物检测此12个非同胞个体、8个同胞个体及其亲本并构建聚类树,结果显示,8个同胞个体样本与其亲本聚为一支,12个非同胞个体则聚为另一支,说明此11个微卫星位点具有较好的家系鉴定能力。采用这11对微卫星引物对由7尾雄性、13尾雌性选育亲本繁育的126尾子代进行亲权鉴定,模拟分析发现,各微卫星位点的双亲非亲排除率为0.276;.895,最高累计双亲非亲排除率为99.999%;亲权鉴定结果显示,126个子代中有105尾成功构建系谱信息,鉴定成功率为83.3%,说明这11个位点不仅具有较高的累计排除率,在实际应用中也可有较好的鉴定效果。本研究中翘嘴鳜亲权鉴定技术的建立将为翘嘴鳜选育种提供有效的系谱鉴定技术手段。

关键词：翘嘴鳜亲权鉴定微卫星单核苷酸多态性(SNP) 双酶切限制性酶切位点关联DNA测序(ddRAD-seq)

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大口黑鲈源维氏气单胞菌的分离鉴定

南方水产科学 2021年第3期17卷 54-61页

作者：杨超董浚键刘志刚孙成飞赵飞叶星上海海洋大学/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380

为查明2020年春季广东省佛山市某养殖场人工养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)鱼苗出现暴发性死亡的病因,该研究对患病大口黑鲈鱼苗肝脏组织中分离的一株细菌GZXR2020进行了分子鉴定,PCR扩增获得该菌株的16S rRNA基因和gyrB基因全长... 详细信息

为查明2020年春季广东省佛山市某养殖场人工养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)鱼苗出现暴发性死亡的病因,该研究对患病大口黑鲈鱼苗肝脏组织中分离的一株细菌GZXR2020进行了分子鉴定,PCR扩增获得该菌株的16S rRNA基因和gyrB基因全长序列,BLAST显示其与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的相应序列高度同源,同源性分别高于99.5%和98.3%。根据VITEK2全自动细菌鉴定系统45个理化项目的鉴定结果、羊血琼脂平板溶血实验呈β-溶血的结果,进一步通过毒力基因检测并结合补充理化鉴定结果,可判断此分离菌株为维氏气单胞菌温和生物型(*** ***)。人工回归感染实验采用低、中、高3种菌液浓度(3×10^(7)、1.5×10^(8)和3×10^(8)CFU·mL^(−1))进行腹腔注射攻毒,可分别导致7%、40%和100%的死亡率,证实维氏气单胞菌温和生物型是引起此次大口黑鲈暴发性死亡的致病原。药物敏感性实验显示,在所检测的17种抗菌药物中,该菌株对大观霉素、氟罗沙星、氟苯尼考等7种药物敏感。

关键词：大口黑鲈维氏气单胞菌温和生物型 gyrB基因生理生化鉴定人工回归感染耐药分析

帕瑞昔布钠超前镇痛对老年患者全麻术后认知功能及炎性因子的影响

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现代中西医结合杂志 2017年第2期26卷 204-206页

作者：孙成飞滨州医学院烟台附属医院山东烟台264100

目的观察帕瑞昔布钠超前镇痛对老年患者全麻下腹腔镜胆囊切除术后认知功能及炎性因子的影响。方法将60例择期在全身麻醉下行腹腔镜胆囊切除术患者随机分为帕瑞昔布钠组和对照组。帕瑞昔布钠组于麻醉诱导前30 min静脉注射帕瑞昔布钠40 mg... 详细信息

目的观察帕瑞昔布钠超前镇痛对老年患者全麻下腹腔镜胆囊切除术后认知功能及炎性因子的影响。方法将60例择期在全身麻醉下行腹腔镜胆囊切除术患者随机分为帕瑞昔布钠组和对照组。帕瑞昔布钠组于麻醉诱导前30 min静脉注射帕瑞昔布钠40 mg,对照组静脉注射生理盐水5 m L。于术前1 h(t0)、术后2 h(t1)、术后24 h(t2)及术后48 h(t3)各时点采用简易智力状态检查表(MMSE)进行评分,抽取静脉血采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果帕瑞昔布钠组患者t1及t2时MMSE评分及血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于对照组(P均0.05);帕瑞昔布钠组t1及t2时血清IL-Iβ、IL-6和TNF-α水平均明显低于t0时(P均0.05)。结论帕瑞昔布钠可以抑制炎性反应,减少老年患者全麻术后早期认知功能障碍的发生。

关键词：帕瑞昔布钠老年人全身麻醉术后认知功能障碍炎性因子

Tgf2转座子介导的草鱼、团头鲂和鲫插入诱变研究

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农业生物技术学报 2018年第1期26卷 11-19页

作者：孙成飞邹曙明陈杰蒋霞云上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心/农业部淡水水产种质资源重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室

转座子介导的插入诱变（insertional mutagenesis）策略在养殖鱼类功能基因发掘和解释方面有着重要的研究意义。本研究以高效Tgf2转座子为研究基础,构建了pTgf2-β-actin-eGFP、pTgf2-EF1α-eGFP、pTgf2-Myo D-eGFP和pTgf2-Krt8-eGFP这4种带有不同启动子的供体质粒,以及pCS2-gf TP这种gf TP转座酶mRNA的体外表达的辅助质粒。将供体质粒和gf TP转座酶mRNA一起注射到草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）和鲫（Carassius auratus）的1;细胞期受精卵中,经对子代增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）整合率的检测和筛选,初步构建了1个以转座子为工具介导的插入诱变库。实验表明,在早期胚胎中,鲫和团头鲂的荧光率达到90%,在草鱼中则高达95%,随着供体质粒注射的改变,表现出肌肉、表皮及全身不同的绿色荧光发光特征。eGFP基因平均整合率在3种鱼类子代平游期的为50%;3%,在1龄阶段为33.0%;6.1%。在3种鱼类中得到插入诱变突变体,获得草鱼阳性个体162尾,其中有45尾表型明显差异;鲫阳性个体60尾,其中有14尾表型明显差异;团头鲂阳性个体51尾,其中有10尾表型明显差异。结果表明,通过插入Tgf2转座子,可在草鱼、团头鲂和鲫等鲤科鱼类中实现基因组的插入诱变,本研究结果可为目标性状功能基因的挖掘和功能机制研究积累一定的基础。

关键词：草鱼团头鲂鲫 Tgf2转座子插入诱变

生长相关优势基因型在大口黑鲈‘优鲈1号’选育世代中的聚合

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华南农业大学学报 2014年第1期35卷 7-11页

作者：徐磊白俊杰李胜杰孙成飞中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

【目的】以先前研究所获得的8个与大口黑鲈生长性状相关的分子标记为检测目标，分析其优势基因型在大口黑鲈选育群体中的分布数量，探索生长相关分子标记应用于大口黑鲈基因聚合育种的潜在可行性．【方法】采用STR基因分型技术对大口黑... 详细信息

【目的】以先前研究所获得的8个与大口黑鲈生长性状相关的分子标记为检测目标，分析其优势基因型在大口黑鲈选育群体中的分布数量，探索生长相关分子标记应用于大口黑鲈基因聚合育种的潜在可行性．【方法】采用STR基因分型技术对大口黑鲈‘优鲈1号’F2、F3、F5和F6选育群体的生长标记基因型进行检测，8个生长标记中含有4个单核苷酸多态性位点（分别位于IGF-I、POUIF1、PSS皿和MSTN基因上）和4个微卫星位点（分别是JZL60、JZL67、MisaTpw76和MisaTpw117）．【结果和结论】试验鱼所含优势基因型的数量为0—6个，F2、F3、F5和F6选育群体中优势基因型的分子标记平均数量依次为2．12、2．70、2．90和3．08，呈现逐代递增趋势；优势基因型的分子标记数量与大口黑鲈生长速度呈同步递增趋势，说明人工选育在一定程度上聚合了优势基因．

关键词：优势基因型聚合 STR 基因分型大口黑鲈选育

基于转录组测序对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)2种肌球蛋白重链基因的克隆与分析

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渔业科学进展 2017年第3期38卷 51-61页

作者：陈之航董浚键孙成飞田园园叶星中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380 上海海洋大学水产与生命技术学院上海201306

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼... 详细信息

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE(Rapid amplification of c DNA ends)克隆到其全长c DNA(MYH-7a,MYH-7b)。MYH-7a全长为6071 bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp。序列分析显示,2个MYH均有Loop1、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白。实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组。翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用。

关键词：翘嘴鳜转录组测序肌球蛋白重链 cDNA克隆表达分析

草鱼两个肌肉生长抑制素cDNA克隆、表达及过量表达对胚胎发育的影响

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生物技术通报 2011年第8期27卷 153-160,166页

作者：濮剑威孙成飞蒋霞云邹曙明上海海洋大学农业部种质资源与利用重点开放实验室上海201306

肌肉生长抑制素(MSTN)是抑制肌肉生长和发育的重要生长调控因子。通过cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆草鱼MSTN-1型和MSTN-2型全长cDNA。RT-PCR分析结果表明,MSTN-1在草鱼肌肉、脑和眼中的转录量较高,在肝胰脏、脾脏和心的转录量较低,在... 详细信息

肌肉生长抑制素(MSTN)是抑制肌肉生长和发育的重要生长调控因子。通过cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆草鱼MSTN-1型和MSTN-2型全长cDNA。RT-PCR分析结果表明,MSTN-1在草鱼肌肉、脑和眼中的转录量较高,在肝胰脏、脾脏和心的转录量较低,在肠、腮、性腺和肾中无表达;MSTN-2只在脑和肌肉中有表达。在草鱼胚胎发育的0-36 hpf期间,MSTN-1的转录量较低;在胚胎发育的36-48 hpf期间,其转录量呈逐渐升高的趋势;MSTN-2各时相均无表达,可能因为该基因在草鱼胚胎发育过程中不起重要作用。通过分别显微注射MSTN-1型和MSTN-2型mRNA至斑马鱼1-2细胞期胚胎。结果显示,注射MSTN-1型mRNA过表达可导致斑马鱼体节发生期胚胎的前-后轴拉长,背-腹轴变短,脊索轻微扭曲,以及体节发育受到强烈抑制而不分化等现象。注射MSTN-2型mRNA胚胎早期发育有所延迟并未发生明显变化,但发育至60 h之后尾部明显发生严重弯曲。

关键词：草鱼肌肉生长抑制素克隆过表达