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ATRA干预培养鼠胚神经干细胞联合GDNF移植对脊髓损伤再生修复的作用

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ATRA干预培养鼠胚神经干细胞联合GDNF移植对脊髓损伤再生修复的作...

作者：姚帅辉泸州医学院

学位级别：硕士

目的：研究体外应用1.0μmol/L全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid,ATRA）进行干预，培养鼠胚神经干细胞（neural stem cells, NSCs），联合胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF）移植至脊髓全横断损伤模型大鼠的损伤脊髓，探索该方法对脊髓损伤后神经再生和修复的作用。方法：（1）取孕2周SD大鼠胚胎额页皮层组织，置于含神经生长因子(20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF)的无血清培养液内悬浮培养，细胞接种密度为l×106/ml，5～7天传代;取传三代的NSCs，在含1.0μmol/LATRA的培养液中诱导培养7天，用免疫荧光染色法鉴定神经干细胞特异性表面标志物Nestin及NSE、GFAP抗体的表达。选取高密度增殖的NSCs用BrdU进行标记，以备移植。（2）将60只雌性SD大鼠（200～250g）用2%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，制备胸段（T9-T11）脊髓全横断损伤模型。大鼠随机分为6组:正常组（n=10）、假手术组（n=10）、损伤对照组（n=10）、ATRA干预组（n=10）、GDNF组（n=10）、ATRA+GDNF组（n=10）。假手术组仅行椎板切除，不做其他干预;损伤对照组行脊髓横断，使用微量注射器注入生理盐水(15μl/天,连续7天);ATRA干预组脊髓横断后,使用微量注射器注入10μl含有2×105/μlBrdU标记的NSCs;GDNF组脊髓横断后,通过蛛网膜下腔导管注入GDNF(15μl/天,连续7天);ATRA+GDNF组脊髓横断后,通过蛛网膜下腔导管同时注入NSCs和GNDF(NSCs10μl, GDNF15μl,共25μl/天,连续7天)。每组大鼠于移植前1d、移植后1、2、5、8周进行行为学评估大鼠后肢运动功能的变化，实施电生理检查及筛网走道实验进一步检测大鼠感觉及运动功能恢复情况;于移植后2、5、8周进行心脏灌注，分别取损伤段、造模段和移植段脊髓组织作苏木素-依红(HE)染色，作组织学观察及5-溴脱氧尿嘧啶核苷/胶质纤维酸性蛋白（BrdU/GFAP）和微管相关蛋白-2/胶质纤维酸性蛋白（MAP-2/GFAP）免疫荧光双标检测并追踪标记移植细胞的分化与分布，检测神经纤维再生情况。使用SPSS20.0统计学软件行单因素方差分析，P0.05），ATRA+GDNF组与ATRA干预组及GDNF组之间差异有统计学意义(P<0.05)，但相比正常组和假手术组仍有差异（P<0.05）。（5）HE染色光镜下观察脊髓横断后病理变化：2周时可见组织坏死，神经元变性或消失，白质内可见弥散分布的小囊腔;5周时损伤区结构紊乱，有空洞及胶质瘢痕形成，神经元形态趋向正常，轮廓清晰;8周时可见星形胶质细胞增生并大量聚集在瘢痕周围，部分细胞轴突再生并相互交错，空洞减少。（6）移植后NSCs存活情况观察：移植后2周，损伤节段可见大量橘红色BrdU标记的阳性细胞，主要分布于灰、白质，高倍镜下NSCs呈圆形或椭圆形，细胞从移植中心向四周迁移，主要聚集在纤维束和空洞周围，5周时，损伤节段仍可见较多BrdU阳性细胞，但灰质内存活的细胞数量明显少于白质，8周时，ATRA干预组脊髓内BrdU阳性细胞数量减少，但ATRA+GDNF组脊髓内仍有大量移植细胞存活。GDNF组未见BrdU标记的阳性细胞。（7）免疫荧光双标染色观察：移植后2、5周ATRA干预组、ATRA+GDNF组荧光双标GFAP阳性细胞主要分布于脊髓断端灰、白质空洞部位，部分向四周迁移，可见胞体呈现出草绿色荧光，向周围伸出数条放射状突起，8周时GFAP阳性细胞明显减少，部分存活细胞伸出突起并相互交织

关键词：脊髓损伤神经干细胞全反式维甲酸胶质细胞源性神经营养因子移植免疫荧光

全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子及硫酸软骨素酶ABC移植修复大鼠脊髓损伤的研究

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中国修复重建外科杂志 2015年第8期29卷 1009-1015页

作者：廖烨晖钟德君康敏姚帅辉张毅余永涛泸州医学院附属医院脊柱外科四川泸州646000 泸州医学院附属医院消化内科四川泸州646000

目的探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)干预培养的鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neur otrophic factor,GDNF)、硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)移植治疗大鼠脊髓损伤的效果。方法取健康成年雌性SD大鼠60只,体重200~250 g,随机分为5组(n=12),分别为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、NSCs+GDNF移植组(C组)、NSCs+Ch ABC移植组(D组)、NSCs+GDNF+Ch ABC移植组(E组)。B^E组于T10平面横断脊髓建立脊髓全横断损伤模型,A组仅显露硬脊膜但不损伤脊髓。于术后第8天将Brd U标记的ATRA干预培养的鼠胚NSCs移植至C、D、E组大鼠,第8~14天C^E组每天对应给予10μL GDNF、10μL Ch A BC,A、B组给予等量生理盐水。术后观察大鼠一般情况;于术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB评分评估大鼠双后肢运动功能,采用体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)评估神经传导功能。移植8周处死各组大鼠,取移植节段脊髓行HE染色和免疫荧光染色观察。结果造模术后共5只大鼠死亡,均补充。造模术后各时间点,B^E组大鼠BBB评分均较A组降低,SEP潜伏期均较A组延长,差异有统计学意义(P0.05);移植2、5、8周,C^E组大鼠双后肢功能逐步恢复,各时间点BBB评分均高于B组,SEP潜伏期均短于B组,差异有统计学意义(P<0.05);移植5、8周,E组BBB评分高于C、D组,SEP潜伏期短于C、D组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色示,A组灰、白质分界清楚,细胞排列规则;B组损伤区血管形态欠完整,细胞排列紊乱,可见囊腔及胶质瘢痕形成;C^E组细胞增生明显,坏死囊腔较B组小。免疫组织荧光染色示,A、B组未见明显Brd U标记阳性细胞;C、D、E组Brd U阳性细胞胞体呈橘红色,E组阳性细胞多于C、D组(P<0.05)。C^E组神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞少于A、B组,E组少于C、D组,差异均有统计学意义(P<0.05)。C^E组抗微管相关蛋白2阳性细胞多于A、B组,E组多于C、D组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论经ATRA干预培养的NSCs联合GDNF及Ch ABC移植对大鼠脊髓损伤再修复的促进作用优于NSCs分別联合GDNF、Ch ABC,提示GDNF、Ch ABC在治疗脊髓损伤修复过程中具有协同作用。

关键词：神经干细胞胶质细胞源性神经营养因子硫酸软骨素酶ABC 脊髓损伤大鼠

IL-6基因多态性与青少年特发性脊柱侧凸易感性及支具矫形疗效的相关性研究

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中国修复重建外科杂志 2018年第6期32卷 678-684页

作者：高军胜张陆刘志昂姚帅辉高松明郑州人民医院骨科郑州450000

目的探讨IL-6基因启动子区-174位点多态性与青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)易感性、支具矫形疗效的相关性,分析其可能的机制。方法以2013年1月–2016年1月收治并符合选择标准的182例AIS患者,以及同期体检... 详细信息

目的探讨IL-6基因启动子区-174位点多态性与青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)易感性、支具矫形疗效的相关性,分析其可能的机制。方法以2013年1月–2016年1月收治并符合选择标准的182例AIS患者,以及同期体检的无脊柱异常青少年210例,作为研究对象。检测所有研究对象IL-6基因启动子区-174位点基因型,血清IL-6水平,股骨颈及腰椎骨密度(bone mineral density,BMD),骨代谢参数骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)、骨钙素(bone gla protein,BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b,TRACP-5b),尿钙(Ca)、尿肌酐(Cr)水平并计算尿Ca/Cr。根据是否患AIS以及基因型检测结果将研究对象分别分为AIS组和对照组以及GG型、CG型、CC型组,根据支具治疗有无进展,将AIS患者分为进展组和无进展组;对以上检测指标分别进行统计学分析。结果 AIS组及对照组仅AIS家族史、股骨颈及腰椎BMD比较,差异有统计学意义(P<0.05)。根据治疗1年后检查结果,182例AIS患者分为无进展组(110例)和进展组(72例);单因素分析显示,两组IL-6基因启动子区-174等位基因、IL-6基因启动子区-174基因型、股骨颈及腰椎BMD、IL-6、TRACP-5b、尿Ca、尿Ca/Cr比较,差异有统计学意义(P<0.05);进一步多因素分析显示,腰椎BMD、TRACP-5b、尿Ca是支具矫形疗效的影响因素(P<0.05)。根据基因检测结果,所有研究对象分为GG型264例、CG型104例、CC型24例。其中,GG型携带者IL-6、TRACP-5b、尿Ca、尿Ca/Cr显著高于CG型和CC型(P<0.05),股骨颈及腰椎BMD显著降低(P<0.05)。CG型携带者仅腰椎BMD显著低于CC型(P<0.05)。结论 IL-6基因启动子区-174位点多态性与AIS易感性不相关,但与支具治疗后的脊柱侧凸进展相关但不独立相关,携带G基因者出现脊柱侧凸进展风险更高,其机制可能是IL-6基因启动子区-174位点基因型影响IL-6的表达水平,并通过骨代谢中的骨吸收影响BMD。

关键词：青少年特发性脊柱侧凸 IL-6基因多态性支具矫形疗效骨密度

局部应用氨甲环酸减少老年股骨颈骨折全髋关节置换后引流的安全和有效性

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中国组织工程研究 2021年第9期25卷 1381-1386页

作者：张冲刘志昂姚帅辉高军胜姜岩张陆郑州人民医院骨二科河南省郑州市450000

背景:局部应用氨甲环酸可减少退变性疾病行全髋关节置换后的引流,但其应用于单纯老年股骨颈骨折行初次全髋关节置换的研究报道相对较少。目的:分析局部应用氨甲环酸减少老年股骨颈骨折患者全髋关节置换后引流的安全和有效性。方法:纳入2... 详细信息

背景:局部应用氨甲环酸可减少退变性疾病行全髋关节置换后的引流,但其应用于单纯老年股骨颈骨折行初次全髋关节置换的研究报道相对较少。目的:分析局部应用氨甲环酸减少老年股骨颈骨折患者全髋关节置换后引流的安全和有效性。方法:纳入2019年1至12月郑州人民医院收治的45例老年股骨颈骨折患者,男19例,女26例,年龄59-82岁,均接受全髋关节置换治疗,其中21例全髋关节置换手术完成缝皮后经引流管逆行注入氨甲环酸(观察组),24例全髋关节置换手术完成缝皮后经引流管逆行注入生理盐水(对照组)。记录术后引流量与不良事件发生情况,密切观察切口愈合情况,检查凝血功能。试验获得郑州人民医院医学伦理委员会批准。结果与结论:①所有患者术后切口均甲级愈合,术后未出现心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、下肢深静脉血栓;②观察组术后3 d内的总引流量、血红蛋白丢失量少于对照组(P0.05);④结果表明,局部应用氨甲环酸在老年股骨颈骨折患者全髋关节置换中安全有效,在不影响凝血功能的情况下可显著减少术后引流量。

关键词：骨假体关节置换股骨颈骨折全髋关节置换氨甲环酸凝血功能术后引流

腰椎间盘突出症术后并发脑脊液漏的相关因素分析与护理对策

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中国现代药物应用 2016年第13期10卷 230-231页

作者：李影姚帅辉郑州人民医院骨二科 450003

目的探讨腰椎间盘突出症术后并发脑脊液漏的相关因素及护理干预措施。方法回顾性分析18例腰椎间盘突出症术后并发脑脊液漏患者的临床资料。结果 18例患者经过保守治疗均获得痊愈,脑脊液漏病程4~17 d,未出现感染、切口裂开等并发症,随... 详细信息

目的探讨腰椎间盘突出症术后并发脑脊液漏的相关因素及护理干预措施。方法回顾性分析18例腰椎间盘突出症术后并发脑脊液漏患者的临床资料。结果 18例患者经过保守治疗均获得痊愈,脑脊液漏病程4~17 d,未出现感染、切口裂开等并发症,随访期间未出现脑脊液疝等情况。结论对腰椎间盘突出症术后并发脑脊液漏的患者采用有针对性的护理措施,能有效缓解脑脊液漏患者的症状、缩短病程、达到临床治愈的效果。

关键词：腰椎间盘突出症脑脊液漏护理对策

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儿童寰枢椎半脱位的康复护理

中国医学工程 2015年第12期23卷 175-175,180页

作者：李影姚帅辉郑州人民医院河南郑州450003

目的总结儿童寰枢椎半脱位的护理经验。方法对46例寰枢椎半脱位患儿行持续枕颌带牵引1-2周,颈托固定2-3周,牵引过程中患儿绝对卧床,维持有效牵引,重视安全管理,加强对患儿及家属进行健康教育。结果 46例患儿经牵引后头颈偏斜和颈部疼痛... 详细信息

目的总结儿童寰枢椎半脱位的护理经验。方法对46例寰枢椎半脱位患儿行持续枕颌带牵引1-2周,颈托固定2-3周,牵引过程中患儿绝对卧床,维持有效牵引,重视安全管理,加强对患儿及家属进行健康教育。结果 46例患儿经牵引后头颈偏斜和颈部疼痛症状消失,头颈部活动正常,X线显示寰枢关节解剖位置恢复正常,3个月随访期间无复发。结论枕颌带牵引治疗,同时加强与患儿及家属健康教育,积极预防并发症,做好出院宣教,取得了满意的效果。

关键词：儿童关节脱位颈椎病

Quadrant微创通道与常规后路开放椎弓根钉棒内固定治疗无神经损伤胸腰椎骨折的疗效

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颈腰痛杂志 2019年第2期40卷 270-272页

作者：高志军朱俊姚帅辉郑州人民医院骨一科河南郑州450003

目的比较Quadrant微创通道与常规后路开放椎弓根钉棒内固定治疗无神经损伤胸腰椎骨折的疗效。方法纳入2013-06～2016-06,于我院骨科治疗的84例无神经损伤胸腰椎骨折患者,将采用Quadrant微创通道下椎弓根钉棒内固定治疗的38例设为观察组... 详细信息

目的比较Quadrant微创通道与常规后路开放椎弓根钉棒内固定治疗无神经损伤胸腰椎骨折的疗效。方法纳入2013-06～2016-06,于我院骨科治疗的84例无神经损伤胸腰椎骨折患者,将采用Quadrant微创通道下椎弓根钉棒内固定治疗的38例设为观察组,常规后路开放椎弓根钉棒内固定治疗的46例设为对照组。比较两组患者手术时间、住院时间等指标,记录两组术后7 d、6个月、2年的Cobb角、ODI评分、VAS评分,并统计并发症发生情况。结果观察组术中出血量、切口长度、住院时间均显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);两组术后VAS评分均显著降低,且术后7 d观察组显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);两组术后ODI评分、Cobb角均显著降低,差异有统计学意义(P0.05),两组术后Cobb角差异均无统计学意义(P>0.05);观察组切口感染率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),两组均无内固定松动等严重并发症出现。结论无神经损伤胸腰椎骨折采用Quadrant微创通道下椎弓根钉棒内固定治疗,能获得与常规后路开放椎弓根钉棒内固定治疗一致的近期疗效,但Quadrant微创通道手术创伤更小,术后短期疼痛症状缓解效果更优。

关键词： Quadrant通道后路手术椎弓根钉棒内固定胸腰椎骨折

右归丸辅助骨髓间充质干细胞对家兔骨质疏松性骨折愈合的影响及机制初探

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国际医药卫生导报 2024年第3期30卷 453-459页

作者：朱俊姚帅辉郭小磊郑州人民医院骨一科郑州450003

目的探讨右归丸辅助骨髓间充质干细胞对家兔骨质疏松性骨折愈合的影响及可能机制。方法研究时间为2023年1月至6月。将50只家兔分为正常对照组、模型对照组、右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组,各10只。除正常对照组外其余各组... 详细信息

目的探讨右归丸辅助骨髓间充质干细胞对家兔骨质疏松性骨折愈合的影响及可能机制。方法研究时间为2023年1月至6月。将50只家兔分为正常对照组、模型对照组、右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组,各10只。除正常对照组外其余各组建立骨质疏松性骨折模型,并予以相应药物治疗。治疗结束后,测定家兔股骨骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度以及股骨弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力;实时聚合酶链式反应及蛋白印迹法测定股骨Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)基因与蛋白水平。采用单因素方差分析及LSD-t检验进行数据分析。结果模型对照组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度,股骨弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力,股骨JAK2、STAT3 mRNA和蛋白水平均低于正常对照组(均P<0.05),骨小梁分散度高于正常对照组(P<0.05);右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、股骨弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力、股骨JAK2、STAT3 mRNA和蛋白水平均高于模型对照组(均P<0.05),骨小梁分散度低于模型对照组(均P<0.05);联合治疗组股骨BMD[(1.76±0.13)g/cm^(3)]、骨小梁数量[(5.87±0.24)个/mm]、骨小梁厚度[(0.14±0.03)mm],股骨弹性模量[(343.27±21.04)MPa]、刚度[(904.25±73.25)N/mm]、最大应力[(32.63±3.17)N/mm^(2)]、最大承载力[(358.85±13.02)N],股骨JAK2、STAT3 mRNA[(3.45±0.26)、(3.60±0.28)]和蛋白[(0.82±0.05)、(0.84±0.05)]水平高于右归丸组[(1.41±0.15)g/cm^(3)、(3.88±0.28)个/mm、(0.10±0.02)mm、(304.62±20.41)MPa、(698.52±69.55)N/mm、(25.34±3.22)N/mm^(2)、(297.34±13.24)N、(2.58±0.26)、(2.29±0.23)、(0.60±0.05)、(0.53±0.07)]、骨髓间充质干细胞组[(1.47±0.14)g/cm^(3)、(3.89±0.28)个/mm、(0.09±0.03)mm、(299.54±16.94)MPa、(720.33±69.48)N/mm、(23.24±3.13)N/mm^(2)、(289.38±13.13)N、(2.63±0.25)、(2.30±0.24)、(0.59±0.06)、(0.53±0.08)](均P<0.05),骨小梁分散度[(0.34±0.02)mm]低于右归丸组[(0.42±0.03)mm]、骨髓间充质干细胞组[(0.43±0.03)mm](均P<0.05)。结论右归丸辅助骨髓间充质干细胞能明显促进家兔骨质疏松性骨折愈合,其机制可能与右归丸辅助骨髓间充质干细胞治疗能激活骨质疏松性骨折家兔股骨JAK2/STAT3信号通路有关。

关键词：骨质疏松性骨折右归丸骨髓间充质干细胞愈合 JAK2/STAT3信号通路动物实验

ATRA干预培养鼠胚神经干细胞联合GDNF移植对脊髓损伤再生修复的作用

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山东医药 2014年第22期54卷 29-31页

作者：姚帅辉钟德君康敏廖烨辉张毅泸州医学院研究生院四川泸州646000 泸州医学院附属医院

目的体外应用全反式维甲酸(ATRA)进行干预培养的鼠胚神经干细胞(NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)移植至大鼠损伤脊髓,探讨其对脊髓损伤再生修复的效果。方法体外应用ATRA 1.0μmol/L浓度下诱导NSCs,将60只雌性SD大鼠随机分为... 详细信息

目的体外应用全反式维甲酸(ATRA)进行干预培养的鼠胚神经干细胞(NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)移植至大鼠损伤脊髓,探讨其对脊髓损伤再生修复的效果。方法体外应用ATRA 1.0μmol/L浓度下诱导NSCs,将60只雌性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、损伤对照组、ATRA干预组、GDNF组、ATRA+GDNF组,每组10只。损伤对照组、ATRA干预组、ATRA+GDNF组、GDNF组大鼠行胸段脊髓全横断损伤效果。术后于移植前1 d、移植后1、2、5、8周,评估大鼠双后肢运动功能,测定运动诱发电位(MEP)评估神经传导功能,采用免疫荧光染色观察移植后NSCs存活情况,5-溴脱氧尿嘧啶核苷/胶质纤维酸性蛋白(BrdU/GFAP)免疫荧光双标染色观察星形胶质细胞分化情况,5-溴脱氧尿嘧啶核苷/微管相关蛋白-2(BrdU/MAP-2)免疫荧光双标染色观察神经元分化情况。评估轴突生长情况。结果 8周后ATRA+GDNF组大鼠行为学评分高于其他各组(P<0.01)。与ATRA干预组及GDNF组相比,8周后ATRA+GDNF组脊髓内GFAP、MAP-2阳性细胞表达面积增大(P<0.05);移植的NSCs在受损脊髓内存活并向周围迁移,后肢运动功能较对照组及ATRA干预组、GDNF组明显改善。结论体外ATRA干预的NSCs联合GDNF移植可有效补充缺失的神经细胞,改善脊髓内微环境,对大鼠后肢功能的改善优于单一应用细胞或神经营养因子移植。

关键词：全反式维甲酸神经干细胞胶质细胞源性神经营养因子脊髓损伤移植