ATRA干预培养鼠胚神经干细胞联合GDNF移植对脊髓损伤再生修复的作用

作     者：姚帅辉 

作者单位：泸州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：钟德君

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：脊髓损伤 神经干细胞 全反式维甲酸 胶质细胞源性神经营养因子 移植 免疫荧光 

摘      要：目的：研究体外应用1.0μmol/L全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid,ATRA）进行干预，培养鼠胚神经干细胞（neural stem cells, NSCs），联合胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF）移植至脊髓全横断损伤模型大鼠的损伤脊髓，探索该方法对脊髓损伤后神经再生和修复的作用。方法：（1）取孕2周SD大鼠胚胎额页皮层组织，置于含神经生长因子(20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF)的无血清培养液内悬浮培养，细胞接种密度为l×106/ml，5～7天传代;取传三代的NSCs，在含1.0μmol/LATRA的培养液中诱导培养7天，用免疫荧光染色法鉴定神经干细胞特异性表面标志物Nestin及NSE、GFAP抗体的表达。选取高密度增殖的NSCs用BrdU进行标记，以备移植。（2）将60只雌性SD大鼠（200～250g）用2%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，制备胸段（T9-T11）脊髓全横断损伤模型。大鼠随机分为6组:正常组（n=10）、假手术组（n=10）、损伤对照组（n=10）、ATRA干预组（n=10）、GDNF组（n=10）、ATRA+GDNF组（n=10）。假手术组仅行椎板切除，不做其他干预;损伤对照组行脊髓横断，使用微量注射器注入生理盐水(15μl/天,连续7天);ATRA干预组脊髓横断后,使用微量注射器注入10μl含有2×105/μlBrdU标记的NSCs;GDNF组脊髓横断后,通过蛛网膜下腔导管注入GDNF(15μl/天,连续7天);ATRA+GDNF组脊髓横断后,通过蛛网膜下腔导管同时注入NSCs和GNDF(NSCs10μl, GDNF15μl,共25μl/天,连续7天)。每组大鼠于移植前1d、移植后1、2、5、8周进行行为学评估大鼠后肢运动功能的变化，实施电生理检查及筛网走道实验进一步检测大鼠感觉及运动功能恢复情况;于移植后2、5、8周进行心脏灌注，分别取损伤段、造模段和移植段脊髓组织作苏木素-依红(HE)染色，作组织学观察及5-溴脱氧尿嘧啶核苷/胶质纤维酸性蛋白（BrdU/GFAP）和微管相关蛋白-2/胶质纤维酸性蛋白（MAP-2/GFAP）免疫荧光双标检测并追踪标记移植细胞的分化与分布，检测神经纤维再生情况。使用SPSS20.0统计学软件行单因素方差分析，P0.05），ATRA+GDNF组与ATRA干预组及GDNF组之间差异有统计学意义(P0.05)，但相比正常组和假手术组仍有差异（P0.05）。（5）HE染色光镜下观察脊髓横断后病理变化：2周时可见组织坏死，神经元变性或消失，白质内可见弥散分布的小囊腔;5周时损伤区结构紊乱，有空洞及胶质瘢痕形成，神经元形态趋向正常，轮廓清晰;8周时可见星形胶质细胞增生并大量聚集在瘢痕周围，部分细胞轴突再生并相互交错，空洞减少。（6）移植后NSCs存活情况观察：移植后2周，损伤节段可见大量橘红色BrdU标记的阳性细胞，主要分布于灰、白质，高倍镜下NSCs呈圆形或椭圆形，细胞从移植中心向四周迁移，主要聚集在纤维束和空洞周围，5周时，损伤节段仍可见较多BrdU阳性细胞，但灰质内存活的细胞数量明显少于白质，8周时，ATRA干预组脊髓内BrdU阳性细胞数量减少，但ATRA+GDNF组脊髓内仍有大量移植细胞存活。GDNF组未见BrdU标记的阳性细胞。（7）免疫荧光双标染色观察：移植后2、5周ATRA干预组、ATRA+GDNF组荧光双标GFAP阳性细胞主要分布于脊髓断端灰、白质空洞部位，部分向四周迁移，可见胞体呈现出草绿色荧光，向周围伸出数条放射状突起，8周时GFAP阳性细胞明显减少，部分存活细胞伸出突起并相互交织