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猪a-干扰素单克隆抗体的制备及其特性鉴定

猪a-干扰素单克隆抗体的制备及其特性鉴定

作者：和燕玲甘肃农业大学

学位级别：硕士

IFN-α(interferon alpha,IFN-α)是在特定诱生剂的作用下由细胞产生的一种具有生物活性的糖蛋白,可诱导同种动物细胞产生广谱的抗病毒活性。目前已发现近百种疫病能通过动物传染给人,其中很多为病毒性传染病,有些目前尚未发现合适的疫... 详细信息

IFN-α(interferon alpha,IFN-α)是在特定诱生剂的作用下由细胞产生的一种具有生物活性的糖蛋白,可诱导同种动物细胞产生广谱的抗病毒活性。目前已发现近百种疫病能通过动物传染给人,其中很多为病毒性传染病,有些目前尚未发现合适的疫苗和药物来预防和治疗,有些对病毒的生物学特性仍未研究清楚。IFN-α是抗病毒能力最强的干扰素,但无论是医学还是兽医学领域对IFN-α临床应用仍然极为有限,因此开展IFN-α单克隆抗体的研制,为评价机体抗病毒水平以及IFN-α作用机制研究奠定基础,对推动IFN-α在临床上广泛应用具有重要作用。本研究运用杂交瘤细胞技术,以重组猪IFN-α蛋白免疫BALB/c小鼠,无菌条件下制备小鼠免疫脾细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合,通过通过GST和GST-pIFN-α双重筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能分泌抗IFN-α的单克隆杂交瘤稳定细胞株。用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定其亚型,确定1株单克隆抗体为IgG2a,2株单克隆抗体为IgG2b。将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的染色体计数,发现杂交瘤细胞株染色体平均数为92条,而骨髓瘤细胞株染色体平均数仅为66条,从遗传角度证明确实获得了杂交瘤细胞株;杂交瘤细胞腹水和细胞上清经ELISA检测,腹水中3株杂交瘤分泌单抗的效价均可达1:105,而细胞上清的效价可达到1:104;单抗的抗原结合位点分析表明,3株单抗的抗原结合位点基本一致;SDS-PAGE结果显示,3株单抗的重链分子量均在60ku以上,轻链分子量在30ku以上;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,3株细胞经3次克隆化培养,细胞上清中的抗体效价均在1:104～1:105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单抗的能力稳定,具有较好的遗传稳定性。

关键词：重组猪IFN-α 重组蛋白单克隆抗体特性鉴定

二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法解析替考拉宁杂质

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色谱 2023年第2期41卷 195-204页

作者：邵伍军陈延安袁红露金美春周雪飞覃玉梅杨荷友和燕玲浙江海正药业股份有限公司浙江台州318000

建立了二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法(2D-UPLC-Q/TOF-MS)对替考拉宁组分分离和杂质结构解析的分析方法,有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱系统不适用于液相色谱-质谱快速鉴定替考拉宁杂质的难题。一维超高效液相... 详细信息

建立了二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法(2D-UPLC-Q/TOF-MS)对替考拉宁组分分离和杂质结构解析的分析方法,有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱系统不适用于液相色谱-质谱快速鉴定替考拉宁杂质的难题。一维超高效液相色谱以Octadecyl silica(ODS)hypersil色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)进行色谱分离,以3.0 g/L磷酸二氢钠溶液(pH 6.0)/乙腈=9/1(v/v)为流动相A、3.0 g/L磷酸二氢钠溶液(pH 6.0)/乙腈=3/7(v/v)为流动相B进行梯度洗脱;二维超高效液相色谱以Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm)进行脱盐,以0.01 mol/L甲酸铵(pH 6.0)和乙腈为流动相进行梯度脱盐洗脱。质谱在电喷雾离子源、正离子模式下,采用全信息串联质谱(MS^(E))模式采集质谱数据,锥孔气流速50 L/h,锥孔电压60 V,离子源温度120℃,雾化气流速900 L/h,雾化气温度500℃,毛细管电压2500 V,碰撞能量20~50 eV。根据杂质精确质量数及其二级质谱信息推导其结构,并对替考拉宁主要成分TA_(2-2)的裂解规律进行了推导,发现了2个母核特征离子;对《欧洲药典》10.0收录的10个组分及22个杂质组分进行二级质谱分析,发现了3个新杂质组分。采用该法既可以使用一维超高效液相色谱根据相对保留时间进行组分准确定位,也可以使用二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱二级质谱信息快速、简便、灵敏地对杂质进行结构鉴定,为替考拉宁的质量控制和工艺优化提供了一种新思路。

关键词：二维超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱替考拉宁杂质解析

猪IFN-α1重组蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其生物学特性

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中国兽医科学 2010年第10期40卷 1057-1062页

作者：和燕玲陈国华王佩雅薛萍房永祥景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经EL... 详细信息

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经ELISA检测,体外细胞培养上清的效价均可达到1∶104,体内腹水的效价均可达1∶105;SDS-PAGE分析显示,纯化的这3株单克隆抗体的重链分子质量均在60ku以上,轻链均在30ku以上,符合抗体IgG重链、轻链分子的大小;抗体亚类鉴定表明4E9、5B2为IgG2a类,5H11株为IgG2b类,且其抗原结合位点基本一致。细胞染色体分析表明,3株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,远高于骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数,从遗传角度证实获得了杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,这3株细胞经多次冻存复苏和传代培养,不同代次细胞上清中的抗体效价均在1∶104～1∶105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的性能稳定。

关键词：重组猪IFN-α1蛋白单克隆抗体生物学特性

2D-UPLC-Q/TOF-MS法对替考拉宁未知杂质结构鉴定

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中国抗生素杂志 2023年第4期48卷 419-425页

作者：邵伍军和燕玲袁红露周雪飞陈延安覃玉梅金美春杨荷友浙江海正药业股份有限公司台州318000

目的建立一种在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-UPLC-Q/TOF-MS)分析方法对替考拉宁未知杂质进行结构分析。方法采用在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,一维液相进行分离,二维液相脱盐后进行质谱分析,根据杂质... 详细信息

目的建立一种在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-UPLC-Q/TOF-MS)分析方法对替考拉宁未知杂质进行结构分析。方法采用在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,一维液相进行分离,二维液相脱盐后进行质谱分析,根据杂质精确分子量及其二级质谱碎片离子与已知主成分结构碎片离子对比,推导其结构。结果该方法采用2D-UPLC-Q/TOF-MS法对替考拉宁未知杂质进行鉴定,鉴定杂质1为A_(3-1)脱N-乙酰基葡萄糖降解物,杂质2为A_(2-2)脱甘露糖降解物。结论该方法可以快速地对替考拉宁未知杂质进行结构鉴定,很好地解决了杂质难以制备进行结构解析的难题。

关键词：在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-UPLC-Q/TOF-MS) 替考拉宁未知杂质结构鉴定

猪TLR7基因胞外区部分片段的克隆、表达及其重组蛋白的纯化分析

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安徽农业科学 2009年第24期37卷 11450-11452,11463页

作者：和燕玲房永祥陈国华刘磊景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学甘肃兰州730070

[目的]获得高表达量的蛋白,为进一步研制单克隆抗体提供较好的免疫原,同时也可为TLR7胞外区该片断蛋白未知区域的结构和功能研究奠定基础。[方法]应用PCR技术从重组质粒pcDNA3.1/CT-GFP-pTLR7上扩增出编码猪TLR7基因胞外区N端第27～202... 详细信息

[目的]获得高表达量的蛋白,为进一步研制单克隆抗体提供较好的免疫原,同时也可为TLR7胞外区该片断蛋白未知区域的结构和功能研究奠定基础。[方法]应用PCR技术从重组质粒pcDNA3.1/CT-GFP-pTLR7上扩增出编码猪TLR7基因胞外区N端第27～202位氨基酸序列,利用BamHⅠ和HindⅢ酶切位点将其插入到原核表达载体PET30a中,重组质粒转化BL21(DE3)后,在不同条件下诱导表达。[结果]经SDS-PAGE分析表明,重组菌表达出约26 kD的融合蛋白,并证实主要以包涵体形式表达,其最佳诱导表达条件是37℃、0.5 mmol/LIPTG诱导6 h,表达量可接近50%;纯化的重组蛋白免疫小鼠后,间接ELISA检测抗体效价,结果该蛋白免疫BALB/c小鼠效价达105。[结论]TLR7胞外区该片断重组蛋白具有很好的抗原性,可以作为单克隆抗体研制的免疫原。

关键词：猪TLR7胞外区片段重组蛋白抗原性

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高效液相色谱法测定白牦牛乳中VC的含量

中兽医医药杂志 2009年第6期28卷 33-35页

作者：和燕玲景志忠甘肃农业大学甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

白牦牛(white yak)是我国甘肃省天祝县特有的畜种资源.白牦牛乳洁白浓香,营养丰富,具有较高的营养价值,对白牦牛乳中维生素含量的研究具有重要的营养学意义和价值[1].有关维生素的分析方法较多,包括药典中的标准方法--碘量法[2]、比色法... 详细信息

白牦牛(white yak)是我国甘肃省天祝县特有的畜种资源.白牦牛乳洁白浓香,营养丰富,具有较高的营养价值,对白牦牛乳中维生素含量的研究具有重要的营养学意义和价值[1].有关维生素的分析方法较多,包括药典中的标准方法--碘量法[2]、比色法[3]、电位滴定法、化学法[4]、气相色谱法、高效液相色谱法和微生物法[5]等,其中以高效液相色谱法应用最广泛.该法具有高效、快速、稳定、可靠、重现性好等特点,并能实现多种维生素的同时测定.

关键词：高效液相色谱法牦牛乳维生素含量 VC 测定营养价值电位滴定法气相色谱法

我国在线旅游产业链、竞争格局与市场发展趋势分析

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商业经济研究 2024年第3期 176-179页

作者：肖燕玲武夷学院福建武夷山354300

在线旅游是旅游行业的增长加速器,具有广阔的市场空间和创新空间。为助力我国在线旅游市场的可持续繁荣发展,本文以在线旅游发展现状为基础,依托详实公开数据,对国内在线旅游产业链、竞争格局与市场发展趋势进行系统分析。研究发现:当... 详细信息

在线旅游是旅游行业的增长加速器,具有广阔的市场空间和创新空间。为助力我国在线旅游市场的可持续繁荣发展,本文以在线旅游发展现状为基础,依托详实公开数据,对国内在线旅游产业链、竞争格局与市场发展趋势进行系统分析。研究发现:当前在线旅游产业链正朝向数字渗透助力实现信息联通整合、数据驱动管理效率最大化、社交应用赋能旅游交易便捷化、智能化支撑平台改善服务闭环等方向升级转型;BAT赋能头部企业,推动在线旅游竞争进入白热化阶段;在线旅游呈现用户年轻化、市场下沉化、产业融合化、发展数字化等发展趋势,未来具有广阔成长空间和创新空间。

关键词：在线旅游产业链竞争格局发展趋势

基于UPLC-MS/MS对阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的质量控制

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化工与医药工程 2022年第6期43卷 29-33页

作者：王琰和燕玲李春燕朱灵龙潘婷叶继威段光玉邵伍军浙江海正药业股份有限公司浙江台州318000

建立了超高效液相-三重四级杆质谱法(UPLC-MS/MS)测定阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的质量控制方法。以0.01 moL/L甲酸铵水溶液和甲醇为流动相,Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(50×2.1 mm 1.8μm)为色谱柱进行... 详细信息

建立了超高效液相-三重四级杆质谱法(UPLC-MS/MS)测定阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的质量控制方法。以0.01 moL/L甲酸铵水溶液和甲醇为流动相,Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(50×2.1 mm 1.8μm)为色谱柱进行梯度洗脱分离,质谱采用正离子多反应监测(MRM)模式采集数据。经验证,该方法线性关系好,检出限低,回收率高,可用于阿卡波糖和米卡芬净钠工艺中异丙苯磺酸甲酯及异丙苯磺酸乙酯的质量控制和工艺优化。

关键词：超高效液相-串联质谱(UPLC-MS/MS) 阿卡波糖米卡芬净钠异丙苯磺酸甲酯异丙苯磺酸乙酯

吡喹酮中氟虫腈残留量的HPLC检测方法研究

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中兽医医药杂志 2022年第5期41卷 74-77页

作者：周雪飞路昭齐欢卢静静丁安平和燕玲高美越邵伍军浙江海正药业股份有限公司浙江台州318000 湖州师范学院生命科学学院浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室浙江湖州313000

基于现有研究成果,提出一种共用设施中交叉污染风险确认方法,即共线产品在转换时残留风险确认的方法学研究。采用高效液相色谱建立吡喹酮中氟虫腈残留的测定方法,采用Waters C_(18)^(+)(100.0 mm×2.1 mm,1.6μm)色谱柱进行分离,以0.05... 详细信息

基于现有研究成果,提出一种共用设施中交叉污染风险确认方法,即共线产品在转换时残留风险确认的方法学研究。采用高效液相色谱建立吡喹酮中氟虫腈残留的测定方法,采用Waters C_(18)^(+)(100.0 mm×2.1 mm,1.6μm)色谱柱进行分离,以0.05%磷酸溶液-乙腈(60∶40)为流动相A,0.05%磷酸溶液-乙腈(20∶80)为流动相B,梯度洗脱,紫外检测器,流速为0.35 mL/min。结果氟虫腈的线性范围为0.0284~0.4735μg/mL,相关系数R^(2)>0.9900,方法检出限浓度为0.0085μg/mL(相当于样品浓度0.85μg/g),定量限浓度为0.0284μg/mL(相当于样品浓度2.84μg/g),样品加标回收率在107.04%~110.21%。结果提示,该方法可以快速、简便、灵敏、准确地定量测定吡喹酮中氟虫腈的残留量。

关键词：共用设备交叉污染吡喹酮氟虫腈高效液相色谱方法学研究