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微小隐孢子虫两个miRNA表达检测及真核表达载体的构建

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微小隐孢子虫两个miRNA表达检测及真核表达载体的构建

作者：呼高伟湖南农业大学

学位级别：硕士

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由原虫隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)引起的一种人兽共患寄生虫病,临床上以自限性水样腹泻为主要症状。截止目前,临床上尚无特效的治疗药物和疫苗。同时,国内外也尚未见隐孢子虫microRNA (miRNA)发现... 详细信息

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由原虫隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)引起的一种人兽共患寄生虫病,临床上以自限性水样腹泻为主要症状。截止目前,临床上尚无特效的治疗药物和疫苗。同时,国内外也尚未见隐孢子虫microRNA (miRNA)发现和研究的报道。因此开展隐孢子虫的microRNA研究不仅有利于了解隐孢子虫的生长发育和调控机制,而且有助于发现新的药物作用靶标或设计新的疫苗,同时为有效防治该病提供新的途径。 1、本实验室在前期工作中构建了微小隐孢子虫小RNA文库,并进行了序列测定和生物信息学分析,获得了微小隐孢子虫miRNA cp-miR-2980、 cp-miR-m0001的序列信息。本研究利用液氮研磨和Trizol试剂提取了6种/基因型隐孢子虫的总RNA,利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit分离隐孢子虫的小RNA,用poly(A)聚合酶加尾后,再进行反转录,得到小RNA的cDNA模板。以微小隐孢子虫5S rRNA为内参,采用荧光定量PCR法检测cp-miR-2980、 cp-miR-m0001在Cryptosporidium andersoni、C. parvum、C. baileyi、 Cryptosporidium mouse genotype、C. cuniculus、C. suis6利,/基因型隐孢子虫卵囊中的表达情况。结果6种/基因型隐孢子虫卵囊均成功地检测出了cp-miR-2980、 cp-miR-m0001基因,但不同种/基因型隐孢子虫卵囊中的表达水平不同。本研究也同时证明荧光定量PCR是一种检测miRNA表达水平的简单、快速、敏感、特异、成本低的方法。 2、从微小隐孢子虫(C. parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980、cp-miR-m0001前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAX1载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA, RT-PCR检测cp-miR-2980、cp-miR-m0001的表达。结果成功地构建了真核表达载体pVAX-cp-miR-2980、 pVAX-cp-miR-m0001, RT-PCR检测证实其均能在真核细胞HCT-8中表达,为后续研究cp-miR2980、cp-miR0001-5p的功能打下了基础。 3、本实验室在前期工作中预测了微小隐孢子虫新的miRNA cp-miRm0001及其靶基因的序列信息,其中的一条靶基因为RAD50。本研究从微小隐孢子虫卵囊基因组DNA扩增到RAD50的3’非编译区(untranslation region, UTR)的部分序列,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pGL3载体上,然后与pVAX-cp-m0001真核表达质粒共转染HCT-8细胞,同时共转染pRL-SV40质粒作为内对照,检测双荧光素酶活性。结果成功构建了含有440bp的RAD50基因3′UTR序列的荧光素酶报告基因重组质粒。将该重组质粒与pVAX-cp-miR-m0001一起共转染HCT-8细胞后,实验组的荧光素酶活性比值与对照组相比显著下降(P<0.05),说明cp-miR-m0001对RAD50的3’UTR荧光素酶报告基因载体的活性有抑制作用,这一抑制作用可能是由于cp-miR-m0001与RAD50的3′UTR的作用而产生的。本研究利用荧光定量PCR技术对6种/基因型隐孢子虫卵囊中cp-miR-2980、 cp-miR-m0001的表达情况进行了检测;构建了真核表达载体pVAX-cp-miR-2980、 pVAX-cp-miR0001并证实其能在真核细胞HCT-8中成功表达;成功构建了Cryptosporidium parvum Iowa Ⅱ RAD50的3′UTR荧光素酶报告基因载体,为进一步研究cp-miR-2980、cp-miR m0001的调控机制和功能提供了基础。

关键词：微小隐孢子虫 microRNA real-time PCR 真核表达质粒靶基因

茶多酚热超声联合处理对冬瓜沙门氏菌数量的影响及其自适应神经网络生长模型的构建

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食品与发酵工业 2020年第9期46卷 101-107页

作者：苗英杰呼高伟付永前台州学院生命科学学院浙江台州318000

鲜切蔬菜易受到食源致病菌的污染,然而传统的高温杀菌技术在鲜切蔬菜中的应用受到很大限制。通过研究热超声技术和茶多酚联合处理对鲜切冬瓜在不同温度储藏过程中沙门氏菌菌落数量的影响,以及自适应神经模糊推理系统(adaptive neuro-fuz... 详细信息

鲜切蔬菜易受到食源致病菌的污染,然而传统的高温杀菌技术在鲜切蔬菜中的应用受到很大限制。通过研究热超声技术和茶多酚联合处理对鲜切冬瓜在不同温度储藏过程中沙门氏菌菌落数量的影响,以及自适应神经模糊推理系统(adaptive neuro-fuzzy inference system,ANFIS),构建了沙门氏菌菌落数量的预测模型。热超声和茶多酚联合处理显著减少了鲜切冬瓜中沙门氏菌的数量约2.20 lg CFU/g(P<0.05);在25、10和4℃温度下储藏时,不同温度下菌落数量变化趋势不同,但处理组的菌落数量均显著低于对照组(P<0.05),表明热超声和茶多酚联合处理是一种具有较大应用潜力的鲜切蔬菜保鲜技术。研究所建立的ANFIS模型,每个输入变量采用2个隶属函数,生成8个因果规则;采用gaussmf隶属函数的ANFIS模型对储藏过程中菌落数量的预测结果最好,其R^2大于0.99,均方根误差小于0.2。

关键词：热超声茶多酚沙门氏菌自适应神经模糊推理系统鲜切蔬菜

ZIF-8作为疫苗佐剂/递送系统的应用研究

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中国生物工程杂志 2024年第7期44卷 81-88页

作者：呼高伟洪纯丽罗希尹龙飞台州学院生命科学学院、台州市生物质功能材料开发与应用重点实验室台州318000

疫苗被认为是疫病防控的有效手段之一,其主要类型包括传统灭活疫苗、弱毒疫苗以及新型蛋白、核酸和多肽疫苗等。新型疫苗的抗原成分多为生物活性物质,容易受到外界环境的影响,单独使用在体内易被代谢且免疫原性弱,必须搭配佐剂使用。不... 详细信息

疫苗被认为是疫病防控的有效手段之一,其主要类型包括传统灭活疫苗、弱毒疫苗以及新型蛋白、核酸和多肽疫苗等。新型疫苗的抗原成分多为生物活性物质,容易受到外界环境的影响,单独使用在体内易被代谢且免疫原性弱,必须搭配佐剂使用。不同类型的疫苗搭配使用的佐剂普遍存在制备过程复杂、生物安全性低、稳定性差、转染效率低等问题。因此,亟待开发一种更加安全、高效、生物相容性好以及易制备的新型疫苗佐剂/递送载体。ZIF-8(zeolitic imidazolate framework-8)是由锌离子和2-甲基咪唑结合而成的一类金属有机框架材料,具有高稳定性、高比表面积、低毒性以及高生物相容性等特点。近年来,由于ZIF-8独特的结构和优异的热稳定性,研究人员通过仿生矿化的方法使ZIF-8包封蛋白、核酸、细菌和病毒等生物活性成分,可作为疫苗新型佐剂/递送载体。概述ZIF-8作为蛋白疫苗、核酸疫苗、灭活疫苗、病毒疫苗递送载体的相关研究进展,以期为疫苗递送载体的研发提供参考。

关键词：金属有机框架材料 ZIF-8 疫苗递送系统

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MicroRNA及其研究现状

中国人兽共患病学报 2012年第2期28卷 167-171页

作者：呼高伟陈兆国程天印许娟湖南农业大学动物医学院长沙410128 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室中国农业科学院动物源性食品安全研究中心上海200241 河南安阳市汤阴县畜牧兽医总站汤阴456150

MicroRNA（miRNA）是一类非编码的内源性小RNA分子，长度约20-25个核苷酸（nucleo-tides，nt），参与调控诸多基因的表达。miRNA的作用方式有2种：一种是通过与靶标基因mRNA的完全匹配结合，促使mRNA发生降解；另一种是通过不完全地与靶... 详细信息

MicroRNA（miRNA）是一类非编码的内源性小RNA分子，长度约20-25个核苷酸（nucleo-tides，nt），参与调控诸多基因的表达。miRNA的作用方式有2种：一种是通过与靶标基因mRNA的完全匹配结合，促使mRNA发生降解；另一种是通过不完全地与靶mRNA的3’非编码区（3’untrans-

关键词： MicroRNA 基因mRNA 非编码区 RNA分子 miRNA 内源性核苷酸多基因

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察

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中国兽医科学 2012年第2期42卷 111-118页

作者：张国恩米荣升周鹏黄燕秦培兰呼高伟曹薇陈兆国中国农业科学院、上海兽医研究所、农业部动物寄生虫学重点开放实验室、中国农业科学院动物源性食品安全研究中心上海200241

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo... 详细信息

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。

关键词：微小隐孢子虫体外感染 HCT-8细胞培养形态

1株大黄鱼源肺炎克雷伯菌的分离鉴定与致病性分析

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水产科学 2023年第2期42卷 268-278页

作者：潘苑霞王文基陈庆涛呼高伟台州学院生命科学学院浙江台州318000

近年来由肺炎克雷伯菌感染水产动物引发的病害频繁发生,严重阻碍了水产养殖业的健康发展。采用细菌分离培养和形态学观察手段自人工饲养发病的大黄鱼肝脏内分离到1株疑似致病菌KPLYC2,并进行鉴定,通过回归感染试验发现,分离株KPLYC2可... 详细信息

近年来由肺炎克雷伯菌感染水产动物引发的病害频繁发生,严重阻碍了水产养殖业的健康发展。采用细菌分离培养和形态学观察手段自人工饲养发病的大黄鱼肝脏内分离到1株疑似致病菌KPLYC2,并进行鉴定,通过回归感染试验发现,分离株KPLYC2可引起与自然发病大黄鱼相似的症状及致其死亡,分离株KPLYC2对大黄鱼的半数致死密度为6.8×10^(6)cfu/mL,而且可引起大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏发生明显组织病理性损伤。分离株KPLYC2还可感染小鼠引发全身多系统性病理损伤。经过生理生化特征检测及16S rRNA序列分析和构建进化树发现,分离株KPLYC2与肺炎克雷伯菌的基因相似度超过99%,因此将分离株KPLYC2鉴定为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示,肺炎克雷伯菌KPLYC2对氨苄西林、青霉素G和四环素等不敏感。笔者首次自大黄鱼体内分离出1株肺炎克雷伯菌并研究其致病性和耐药性,获得的数据将对该病的防控提供参考和依据。

关键词：肺炎克雷伯菌大黄鱼生化特征致病性耐药性

1株大黄鱼源金黄杆菌的分离鉴定和耐药性分析

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中国畜牧兽医 2022年第3期49卷 1135-1143页

作者：蔡杰吴佳怡潘苑霞呼高伟张林州中国科学院深圳先进技术研究院深圳518055 台州学院生命科学学院台州318000 汤阴县畜牧兽医总站汤阴456150

【目的】探究引发浙江省某养殖场大黄鱼发病的病原及其致病性和耐药情况。【方法】无菌条件下剖检发病大黄鱼,取其肝脏和肾脏组织,划线分离培养细菌,通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列分析鉴定分离菌的种属特性,通过人工... 详细信息

【目的】探究引发浙江省某养殖场大黄鱼发病的病原及其致病性和耐药情况。【方法】无菌条件下剖检发病大黄鱼,取其肝脏和肾脏组织,划线分离培养细菌,通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列分析鉴定分离菌的种属特性,通过人工感染和组织切片制备评价分离菌对大黄鱼的致病性,最后通过药敏纸片法检测分离菌的耐药性。【结果】分离菌在培养基上外观为表面凸起、光滑和边缘整齐的黄色圆形菌落;革兰氏染色后光学显微镜下呈现出单个分散或成对分布的红色短棒状杆菌;该分离菌可在麦康凯琼脂上生长,可利用葡萄糖产酸;16S rRNA基因序列相似性分析及系统进化树显示,该分离菌与金黄杆菌相似性高达97.0%以上并聚为一类。动物回归试验结果显示,分离菌可引起大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏发生明显病变,半数致死量为6.32×10^(4) CFU/mL,表明其对大黄鱼具有较强致病性;药敏结果显示,分离菌对阿米卡星和左氧氟沙星敏感,对庆大霉素、新霉素和红霉素中度敏感,对头孢克肟、氨苄西林、卡那霉素、呋喃唑酮等耐药。【结论】本研究分离了大黄鱼源致病株金黄杆菌,并通过其致病性和耐药性研究为金黄杆菌引发水产动物发生病害的防控和治疗提供参考。

关键词：金黄杆菌分离鉴定人工感染序列分析耐药性

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新型猪繁殖与呼吸障碍综合征疫苗研究进展

中国兽医杂志 2015年第5期51卷 61-63页

作者：呼高伟蔡杰余婉婷冯朝兴王乃东邓治邦王爱兵杨毅湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 天津市滨海新区汉沽茶淀畜牧兽医站天津汉沽300480

猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductiveand respiratory syndrome,PRRSV）是由病毒性抗原PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus）引起的,临床上以猪的呼吸和繁殖障碍为主要特征,如猪妊娠后期流产、死胎... 详细信息

关键词：呼吸障碍猪繁殖综合征疫苗呼吸道疾病繁殖障碍妊娠后期哺乳仔猪

杆状病毒介导猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在PK15细胞中的表达与鉴定

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中国兽医学报 2016年第5期36卷 701-706页

作者：呼高伟余婉婷朱哲王占锋邹亚文王乃东王爱兵邓治邦杨毅湖南农业大学动物医学学院逆向动物疫苗研究中心湖南长沙410128

以pFastBac I为载体骨架,通过PCR从pcDNA3.3-TOPO载体引入巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV3.3)强启动子及不同功能调控元件,构建成含有双启动子,能在PK15细胞(porcine kidney cell)中表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)的昆虫杆状病毒转移(穿梭)载体pFastBac I-CMV3.3-eGFP。收获重组杆状病毒,侵染PK15细胞。倒置荧光显微镜下验证该重组转移载体构建成功,根据荧光水平筛选出重组杆状病毒侵染PK15细胞的最佳MOI(multiplicity of infection)和最佳表达强度时间。另将PRRSV(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)GP5蛋白基因克隆到pFastBac I-CMV3.3载体。获得的重组杆状病毒以MOI=100侵染PK15细胞48h后收获细胞产物。Western blot鉴定目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了重组杆状病毒介导PRRSV GP5蛋白在PK15细胞表达系统。因此,建立的重组杆状病毒在PK15细胞中高效表达GP5蛋白的方法,将为研究PRRSV吸附机制,GP5蛋白与宿主细胞互作蛋白的筛选和针对PRRSV基因工程疫苗的开发奠定了坚实的基础。

关键词：重组杆状病毒表达系统猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白GP5 PK15细胞 Western blot